194308. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oligo- és polidezoxiribonukleotidok előállítására
1 194 308 2 ben klónozott 45-mer és a 3 5-mer, s az így kapott vektor tartalmazza az emberi inzulin A láncát kódoló teljes mesterséges gént. mpHIA, vektort PstI és HindlII enzimekkel hasítunk, majd a nagy fragmentumot ammóniumacetátos kicsapással tisztítjuk. Körülbelül 10 ng hasított vektorhoz keverjük a Pstl/Hindlll adapterhez ligáit 35-mert, s a további tekaciókat az általános menet szerint végezzük el. A reakcióelegynek JM101 E, coli törzsbe való transzformációja után fehér plakk okát várunk. Az összesen kapott 24 plakkból 12-t kiválasztunk és egyes szálú fág DNS-t preparálunk belőlük. Szekvenciaanalízis alapján ezek közül 5 rekombináns tartalmazza a kívánt 35-mert is, azaz a 4. példában klónozott 45-mer 41 nukleotidját, s ehhez kapcsolva a jelen példában alkalmazott 35-mert is. Az így kapott mpHIA klón olyan DNS szakaszt tartalmaz, amely az emberi inzulin A láncát képes kódolni (11. ábra). Az ábrán feltüntetett nukleotld sorrendből felírt amlnosavsorrend a klónozott DNS szakaszt kódoló képességét jelenti csupán, de azt nem, hogy az mpHIA expressziója funkcióképes emberi inzulin A láncot eredményez. A kódoló szakasznak az mpHIA vektorból való kivágása Is megfelelő leolvasási fázisban, expressziós vektorba helyezése azonban lehetővé teszi az emberi inzulin A lánc kifejezését. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás oligo- és polidezoxiribonukleotidok előállítására egyes szálú DNS szakasz komplementer szálának enzimatikus úton, dezoxiribonukleodd 5-trifoszfátok jelenlétében végzett kialakításával, azzal jellemezve, hogy az egyes szálú DNS szakaszt, közvetlenül vagy adapter segítségével egy megfelelően hasított vektorhoz kapcsosuk, az egyes szálú szakaszt dezoxiribonukleozid 5 -trifoszfátok jelenlétében ismert módon feltöltjük, a vektort zárjuk, a kapott módosított vektorrá baktériumsejteket transzformálunk, a szelektált transzformáns klónokból a vektort izoláljuk, és a) a kívánt oligo- vagy poiidezoxiribonukleotidot kettős szálú formában kihasítjuk, és a további felhasználástól függően megfelelő kapcsolási véggel rendelkező kettős szálú DNS-t izolálunk, vagy b) a kívánt oligo- vagy poiidezoxiribonukleotidot kettős szálú formában, megfelelő kapcsolási véggel kihasítjuk, az eredetivel azonos vagy különböző vektorhoz az eredetivel azonos vagy különböző egyes szálú oligo- vagy polidezóxiribonukleotiddal egyidejűleg ligáljuk, az egyes szálú szakaszt ismert módon feltöltjük, a vektort zárjuk és a továbbiakban az első oligo- vagy polidezoxlribonukleotid kinyerésének lépéseit és az oligo- vagy polidezoxiribonukletoid méretének növelését egyszer vagy többször ismételj üt, vagy c) az első, klónozott oligo- vagy poiidezoxiribonukleotidot a vektorban hagyva a vektort az oligovagy polidezoxiribonukleotid beépítési pontjánál és egy attól eltérő közeli helyen hasítva linearizáljuk, az eredetivel azonos vagy különböző egyes szálú oligo- vagy polidezoxiribonukleotídot a vektorhoz közvetlenül vagy szintetikus adapterhez kapcsolva ligáljuk, az egyes szálú szakaszt ismert módon feltöltjük, és a továbbiakban az első oligo- vagy polidezoxiribonukleotid klónozásának lépéseit és a DNS szakasz méretének növelését egyszer vagy többször ismételjük. (Elsőbbsége: 1985.05.13.) 2. Az 1. Igénypont szerinti eljárás a z z a 1 j e 1- 1 e m e z v e, hogy kiindulási vektorként M13mp származékokat, baktériumként pedig E. coli JM101 törzset használunk. (Elsőbbsége: 1985.05.13) 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan kiindulási vektorokat használunk, amelyek több, egymáshoz közeli 3 -túlnyúló véget eredményező, a vektorban'csupán egyszer előforduló hasítóhelyet tartalmaznak, előnyösen úgy, hogy a klónozás után az alkalmazott enzimatikus lépések a restrikciós helyek felismerő szekvenciáiból egy vagy legfeljebb két nukleotidot hagynak meg. (Elsőbbsége: 1985.05.13.) 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az egyes szálú DNS szakaszok vektorhoz kapcsolásánál olyan, előnyösen 8-10 bázispár hosszúságú kettős szálú szakasszal rendelkező, adaptert használunk, melynek 5’ túlnyúló vége komplementer a vektornak egy egyedi, 5> túlnyúló véget eredményező hasítási helyével, 3’ túlnyúló vége pedig olyan restrikciós enzimre jellemző, melynek felismerő helye nem fordul elő a vektorban, és előnyösen a hasítás és emésztés után ezen felismerő hely szekvenciáiból egy vagy legfeljebb két nukleotid marad meg. (Elsőbbsége: 1985. 05.13.) 5. Az 14. igénypontok szerinti eljárás a z z a 1 jellemezve, hogy az oligo- vagy poiidezoxiribonukleotidot tartalmazó kiónokat a béta-galaktozidáz alfa-peptid funkciójának helyreállítása alapján választjuk ki. (Elsőbbsége: 1985.05.13.) 6. Eljárás oligo- és polidezoxiribonukleotidok előállítására kémiailag szintetizált egyes szálú DNS szakasz komplementer szálának enzimatikus úton, Klenow polimeráz segítségével, dezoxiribonukleozid 5 -trifoszfátok jelenlétében végzett kialakításával, azzal jellemezve, hogy a kémiailag szintetizált egyes szálú DNS szakaszt, közvetlenül vagy adapter segítségével egy megfelelően hasított vektorhoz kapcsoljuk, az egyes szálú szakaszt Klenow polimerázza1, dezoxiribonukleozid 5 -trifoszfátok jelenlétében ismert módon feltöltjük, a vektort zárjuk, a kapott, módosított vektorral baktériumsejteket transzformálunk, a szelektált transzformáns klónokból a vektort izoláljuk, és a) a kívánt oligonukleotidot kettős szálú formában kihasítjuk, és a további felhasználástól függően megfelelő kapcsolási véggel rendelkező kettős szálú DNS-t vagy szálelválasztás után egyes szálú DNS-t izolálunk, vagy b) a kívánt kettős szálú DNS-t megfelelő kapcsolási véggel izoláljuk, az eredetivel azonos vagy különböző vektorhoz az eredetivel azonos vagy különböző egyes szálú oligonukleotiddal egyidejűleg ligáljuk, az egyes szálú szakaszt ismert módon feltöltjük, és a továbbiakban az első oligonukleotid kinyerésének lépéseit ismételjük, a DNS szakasz méretének növelését egyszer vagy többször Ismételjük, vagy c) az első, klónozott oligonukleotidot a vektorban hagyva a vektort az oligonukleotid beépítési pontjánál és egy attól eltérő közeli helyen hasítva Hnearizáljuk, az eredetivel azonos vagy különböző egyes szálú ollgonukleótidot a vektorhoz közvetlenül vagy szintetikus adapterhez kapcsolva ligáljuk, az egyes szálú szakaszt ismert módon feltöltjük, és a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
