194308. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oligo- és polidezoxiribonukleotidok előállítására
1 194 308 2 töltésével egyidejűleg feltöltődik. A B2 út sematikusan az 5. ábrán láthat^. A klónozó vektort két különböző specifltású, 5 -túlnyúló véget eredményező restrikciós enzimmel (BamHI és Hlndlll) hasítjuk. Közben a PstI és HindlII végekkel rendelkező szintetikus adapter PstI helyéhez 11- gáljuk az egyes szálú, klónozandó ollgonukleotidot. Mivel a ligálás során a Hlndlll helyén az adaptermolekulák önllgálása is létrejöhet, a reakclóelegyet Hlndlll enzimmel kezeljük, s az egyes szálú oligonukleotid-adapter ligátumot izoláljuk, majd a BamHI-HindlII hasított vektor HindlII helyéhez Ugáljuk. Az így kapott vektor egyes szálú szakaszait ezután feltöltjük és cirkulaiizáljuk. Kompetens E. coliba történő transzformálás, és megfelelő szelekció után a rekombináns vektort izoláljuk. A kapott vektort az adapterrel bevitt PstI és HindlII helyeken hasítjuk, s a kihasított adaptermolekulát eltávolítjuk. A második ciklusban a vektor HindlII helyéhez ligáljuk az adapterhez kapcsolt második oligonukleotidot. Az egyes szálú 5 -túlnyúló szakasz feltöltése, s a PstI hasításból származó 3-túlnyúló szakasz eltávolítása egyidejűleg történik Klenow polimerázzal dezoxlribonukleotid 5 ’-trifoszfátok jelenlétében a 4. ábra kapcsán már leírt módon. Blunt-end ligálás, transzformálás és izolálás után így olyan vektorhoz jutunk, amely a két, adapterrel bevitt ollgonukleotidot összekapcsolva tartalmazza úgy, hogy az összekapcsolás helyén csupán egy, a PstI helyből származó C nukleotid marad meg. Ezután az egész folyamat tetszőleges számban, ciklusosán ismételhető, s az összekapcsolt oligonukleotidokból álló DNS szakasz bármely ciklus után BamHI és PstI kettős emésztéssel kihasítható, s a további felhasználásnak megfelelően a 2. ábrához hasonló módon kezelhető. A rekombinánsokra történő szelekció (screenelés) A várható rekombinánsokra történő szelekció minden klónozási módszer elengedhetetlen lépése és ez célszerűen olyan, hogy a kívánt rekombináns a kiindulási vektorból és a nem megfelelően összekapcsolódott rekombinánsoktól könnyen megkülönböztethető legyen. Mi a screenelés és az azt követő nukleotidsorrendmeghatározás szempontjából az M13 fágból kifejlesztett és elteijedten alkalmazott vektorcsaládot (az M13 mp származékokat) választottuk [Messing J., Créa R. és Seeburg P. H. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 309, Messing J. és Vieira J. (1982) Gene 19, 269, Norrander J., Keinpe T. és Messing J. (1983) Gene 26. 101]. Ezek a vektorok a fágfejlődés szempontjából nem létfontosságú szakaszon tartalmazzák az E. coliból származó lac operon egy részletét, nevezetesen az operátort, a promotert és azt a DNS szakaszt, amely a 3-galaktozidáz enzim aminoterminusának egy részletét (1-145 amlnosav az mp7, 1-59 amlnosav az mp8, mp9, mplO, mpllo és ezek egyéb származékai esetében) kódolja. Ez az úgynevezett a-fragment, amely IPTG- vel (izopropü-3-D-tiogalaktropiranozid) indukálható, önmagában nem funkcióképes enzim. A gazda E. coli törzsből hiányzik a kromoszómális 0-galaktozidáz gén, de a törzs tartalmaz egy eplszómát, amely ismét egy nem funkcióképes (3-galaktozldázt, az úgynevezett to-framentet kódol, amelyből a 11-41 amlnosav hiányzik. Amikor az M13 mp fág az ilyen sejtet fertőzi, a két inaktív fragment komplementálja egymást és funkcióképes 3-galaktozidáz enzim jön létre. Az enzimaktivitás detektálására egy laktózanalógot, az X-galt (5-bróm-4-ldór-3-indolfl-3-galaktozid) használják, amelyből 3-galaktozidáz hatására kékszínű vegyület'keletkezflc. így tehát az az M13 fág származék, amely a gazdasejt defektiv enzimjét komplementálja, kék plakkot hoz létre. Az M13 mp fágok által kódolt a-fragment komlementáló képességét nem befolyásolja az amino-terminushoz közeli részlet szerkezete. A különböző M13 mp vektorokba így a komplementáló képesség megszűnése nélkül, az a-peptid általában negyedikhatodik aminosavjának megfelelő helyre 30-50 bázispárnyi DNS szakaszokat építettek be, amely szakaszok a teljes fág DNS-t is figyelembevéve egyedi restrikciós helyek sorozatát (az úgynevezett poli-klónozó szakaszt) tartalmazzák. A poliklónozó szakaszok általában úgy vannak megtervezve, hogy az a-fragment leolvasási fázisa ne tolódjon el, valamint fázisban lévő terminé tor kodont se tartalmazzanak. Ha a poliklónozó helyre idegen DNS szakasz épül be, két eset lehetséges. Nagy valószínűséggel kék plakk képződik akkor, ha a beépült DNS szakasz az a-fragment leolvasási fázisát nem tolja el, s nem tartalmaz fázisban lévő terminátor kodont sem. Fehér plakk képződik leolvasási fáziseltolódás, vagy fázisban lévő terminátor kodon esetében. A beépítendő (esetünkben egyes szálú) DNS lánc hosszának előzetes megtervezése esetén tehát előre várható, hogy a klónozás során kapott rekombináns a klónozó vektorhoz képest színváltozást eredményez-e vagy sem. Ha a kiindulási vektor és a rekombináns azonos színt eredményez, akkor a vektorháttér mellett véletlenszerűen lehet a rekombinánst kiválasztani. A szelekciót könnyebbé teszi, ha színváltozás történik, például a fentiekben leírt kék - fehér változás. A kék - fehér színváltozás sem teszi lehetővé a rekombinánsra való biztos szelekciót, mert az enzimatikus lépések során az esetlegesen jelenlévő nem specifikus szennyező nukleázok olyan mellékreakciókat okozhatnak, amelyek ugyanezt a színváltozást eredményezhetik. Még biztosabb szelekciót ígér a fehér — kék színváltozás. Ebben az esetben mesterségesen olyan vektort állítunk elő, amely tartalmazza ugyan a poliklónozó helyet, de ez eltolja a leolvasási fázist, s így aktív a-fragment szintézise nem lehetséges. Ha a poliklónozó helyre olyan DNS szakasz épül be, amely az a-fragment leolvasási fázisát helyreállítja, akkor kék rekombináns jön létre. Mivel a nem specifikus enzimatikus mellékreakciók nagyobb valószínűséggel adnak fehér, mint kék plakkot, ezért az utóbbi szelekció elvileg a legmegbízhatóbb. A fenti szelekciós módszer a rekombinánsok screenelését nagy mértékben elősegíti, de egyik esetben sem tökéletes. Ezért a rekombinánsok további azonosítása már molekuláris szinten történik. A várható színű rekombinánsokból megfelelően nagy számban egyes szálú DNS-t izolálunk, s az egyes szálú DNS-en egy univerzális primer segítségével a didezoxiszekvenálás egyik, például : C-reakcióját (úgynevezett C-mintázat) minden egyes várható rekombináns fág esetén elvégezzük, kontrollként a kiindulási vektornak megfelelő fág DNS-t használva. Amenynyiben beépül történt, a kiindulási vektorra jellemző C-mintázat, poliaktílamid gélen vizsgálva, felfelé tolódik el, s az eltolódás mértékéből következtetni lehet a beépült DNS szakasz hosszúságára is. A megfelelő hosszúságú rekombinánst ezután nuklein-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
