194306. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikum bioszintézis befolyásolására in vivo genetikai rekombinációval
1 194 306 2 5. táblázat Tör*« Regeneráló lemer (telepek száma/ml) Kanna bidiolsa vas Minimál táptalaj (telepek Rekombinációs frekvencia MNG 169 kezdés előtt 2x10* kezelés után 0 száma/ml) 2,lxl04 404 ura' . 1,5x10* _ 0 MNG 169x 404 ura" 30 2x10s 5. példa Intakt, de életképtelen protoplasztok előállítása és felhasználása fúziós partnerként Mindenben a 4. példában leírt módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy kannabidlolsav-trietil-aminsó helyett 80-240 pgjml pirrol-nitrint vagy 100-300 pig/ml briflant-zöldet használunk kémiai inaktiválószerként. Kísérleteink során a protoplasztok 100%-osan inaktiválódtak. A kapott életképtelen protoplasztokat fúziós partnerként használjuk. 6. példa Intakt, de életképtelen protoplasztok előállítása és felhasználása fúziós partnerként Az 1. példában leírt módon készítünk protoplasztokat, azzal a különbséggel, hogy kiindulási törzsként Streptomyces kanamyceticust (ATCC 12 853) használunk. Az így nyert Streptomyces kanamycetius protoplasztokat a 4. példában leírt módon eljárva, de inaktiválószerként kannabidiolsav helyett 400 és 800 pg/ml N-etil-malein-imidet (EM) alkalmazva, inaktiváljuk. Az eredményeket a 6. táblázatban mutatjuk be: 6. táblázat Regeneráló lemez 800 /ag/ml (Telepek száma/ml) EM-del Nem 400 jug/ml kezelve Törzs kezelt EM-del kezelve Streptomyces 3,2x10s 4,2x10* 0 kanamyceticus (ATTCC 12853) A 800 pglnú N-etil-malein-imiddel kezelt és inaktiválódott protoplasztokat használjuk fúziós partnerként. 7. példa Életképtelen protoplasztok előállítása fizikai inaktivitással Az 1. példában megadottak szerint előállított Streptomyces tenebrarius protoplaszt szuszpenzióját (10* sejt/mii műanyag csőben g^mma-sugarakkal kezeljük (Or °). A 80 krad dózist kapott, s ezáltal inaktiválódott sejteket használjuk fúziós partnerként. 8. példa Nebramicin antibiotikum-komponenseket bioszintetizáló törzsek termelőképességének vizsgálata és antibiotikumot tartalmazó fermentlevek előállítása A vizsgálandó törzs spóráival vagy vegetatív tenyészetével az alábbi összetételű, desztillált vízzel készült ferdeagarokat oltjuk: dextrin 1,0% élesztőkivonat 0,1% kazein-hidrolizátum (10%-os)* 2,0% húskivonat 0,1% kobalt-dikloríd-hexahidrát 0,001% agar 2,5% "cnziniatikusan hidroüzált A táptalaj pH-ját sterflezés előtt vizes nátrium-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be, majd 121°C hőmérsékleten 20 percen át sterilezzük. Négy napon át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, majd a táptalaj felületéről steril desztillált vízzel leválasztjuk a spórákat és az így kapott spóraszuszpenzióval kétszer 100 ml térfogatit Erlenmeyer-lombikokban sterilezett alábbi összetételű, csapvízzel készült inokulum táptalajt oltunk: szójaliszt 2,0% kazein-hidrolizátum (10%-os)* 2,0% ammónium-hidrát 0,1% ammónium-klorid 03% kalcium-karbonát 03% magnézium-szulfát-heptahidrát 0,5% pálmaolaj és lenolaj 1 :1 arányú elegye 3,0% glükóz (külön, 50%-os oldatként sterilezve) 2,0% *enzimatikusan hidroüzált A táptalaj pH-ját vizes nátrium-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be, majd 121°C hőmérsékleten 20 percen át autoklávban sterilezzük. A beoltott tenyészeteket 14-18 órán át, 2,4 cm átmérőjű kör mentén percenként 280-at forduló síkrázógépen 37°C hőmérsékleten tenyésztjük. Az így előállított érett inokulummal 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokban sterilezett 100 ml, vagy 10 liter össztérfogatú laboratóriumi fermentorban 121°C hőmérsékleten 45 percen át sterilezett, 5 liter térfogatú, csapvízzel készült alábbi összetételű főfermentációs táptalajt oltunk: szójaliszt 3,0% kazein-hidroHzátum (10%-os)* 5,0% ammónium-nitrát 0,1% ammónium-klorid 0,5% L-glutaminsav 0,8%g kalcium-karbonát 0,5% magnézium-szulfát-heptahidrát 0,5% kobalt-dinitrát-hexahidrát 0,001% pálmaolaj és lenolaj 1 :1 arányú elegye glükóz (külön, 50%-os oldatként 3,0% sterilezve) enzimatikusan hidroüzált 4,2% A táptalaj pH-ját sterflezés előtt vizes ammónjum-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be. A tenyésztést 37°C hőmérsékleten végezzük. A lombikokban lévő sejteket az előbbiekben jellemzett síkrázógépen tenyésztjük. A fermentor keverőjének fordulatszámát 360/percre állítjuk be. A táptalajon percenként 3 liter steril levegőt vezetünk át. A tenyészetek antibiotikum tartalmát agardiffúbiológiai értékméréssel (I. S. Simpson: Analytical Microbiology, Acad. Press, New York, 1963, 87— 124. oldal) és vékonyrétegkromatográflát követően bioautográfiával határozzuk meg (Kádár Pauncz J. és Harsányi I.: J. Chromat, 195, 251 (1980). Az agardiffúziós biológiai értékméréshez az összantibiotikum tartalom meghatározásakor Staphylococcus epldermidis, míg a nebramicin-5 egyéb nebramicin-komponensek melletti szelektív mérésekor 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
