194306. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikum bioszintézis befolyásolására in vivo genetikai rekombinációval
1 194 306 2 A Wlckerham-vitamin oldat összetétele: fólsav 0,2 mg biotin 0,2 mg Ca-pantotenát 40,0 mg inozit 200,0 mg niacin 40,0 mg p-amino-benzoesav 20,0 mg piridoxin-hldroklodd 40,0 mg aneurin-hidroklorid 40,0 mg riboflavin 20,0 mg deszt. víz 100,0ml Prototrófokat izolálhatunk úgy is, hogy a komplett regeneráló táptalajon kinőtt telepeket, a fenti vagy más összetételű minimal táptalajra replikázzuk. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint a protoplasztok fúzióját úgy végezzük, hogy a fentiek szerint, két vagy több törzsből készített protoplasztokat tetszőleges, előnyösen 1 :1 arányban összekeverjük, majd 0,2 ml protoplaszt keverékhez 2 ml fúziós oldatot adunk. Ennek összetétele a következő : polietilén-glikol : molekulatömege : 4000, 35,0% kalcium-diklorid-dihidrát 0,3% magnézium-diklorid-hexahidrát 0,6%. Az oldat pH-ját vizes nátrium-hldroxid oldattal 7,2 re állítjuk be. A fúziós oldat adagolásakor a protoplasztok aggregálódnak, membránjaik összeolvadnak, azaz megtörténik a fúzió és a két vagy több sejt genetikai információkat hordozó DNS-e egymás közelében jut, így bekövetkezhetnek a genetikai rekombinációs események. Az 1. táblázatban megadjuk a találmány szerinti eljárással és az ismert, a 868 472 és 868 473 számú belga szabadalmi eljárás szerint előállított protoplasztok képződésének és regenerálódásának hatékonyságát. 1. táblázat A Str. tenebrarius protoplasztok képződése és regenerálódásuk ismert és a felen találmány szerinti eljárással Módszer Proto-RegeneráProtoplaszttá át nem alaplasztlódás kult sejtekből fejlődő sejképzőteleptekből fejlődő telep dés, % szám telep- % (90 perc) szám Ismert 92,5 13 0,065 1500 7,5 Jelen leírás szerinti 99,81 18000 90,0 38 0,19 A táblázatból* kitűnik, hogy a találmány szerinti eljárással, kalcium-klorid, magnézium-klorid és szacharóz jelenlétében történő előtenyésztéssel lényegesen növelhető a protoplasztképződés és főként a regenerálódás hatékonysága. A következő példákban néhány in vivo genetikai rekombinációs kísérletet és azok eredményét ismertetjük. 2. példa Auxotróf törzsek fúziója és a rekombináns törzsek antibiotikum bioszintézise a) Az A222 his' és 404 ura' auxotróf törzsek fúziója Az ismert módon, mutagén kezeléssel kapott hisztidin igényű A222 his' és uracil igényű 44 ura' törzset sorrendben a Streptomyces tenebrarius MNG 204 jelű, nyomnyi mennyiségű nembramicin4 mellett nebramicin-5’-t termelő törzséből, Illetve az MNG 169 jelű, nebramicin-2-t, nebramicid4-t és neb ramicin-5’-t bioszintetizáló törzséből állítottuk elő. A két törzsből az 1. példában megadottak szerint eljárva protoplasztokat készítünk, a protoplasztokat fuzionáljuk és regeneráljuk. A prototróf rekombinánsok egy részét izoláljuk. A rekombinációs frekvencia: 5xl0’s. Az izolált prototróf törzsek antibiotikum termelőképességét az 5. példában megadottak szerint meghatározzuk. A 2. táblázatban megadjuk az izolált 147 rekombináns fermentációja után kapott eredményeket. 2. táblázat Az A222 his' és a 404 ura' auxotróf törzsek in vivo DNS rekombinációjával kapott prototrófok antibiotikum termelése Termelőképesség Törzsek % száma (db) Nem termel antibiotikumot 16 10,9 nebramicin-5’ 24 16,3 nebramicin4 11 7,5 nebramicin4 és -5’ 57 38,8 nebramicin-2 és-5’ 7 4,7 nebramidn-2,4 és -5’ 32 21,8 A fúziós partnerek termelőképessége a következő: A222 Ids': nebramicin-2: 0 /ugjml nebrandcin4>: 30 /ugjml nebramicin-5’: 675 /ug/ml 404 ura’: nebramicin-2: 1120 /ug/tnl nebramicin4; 75 /ug/ml nebramicin-5 : 145 itg/ml. A rekombinánsok egy részének termelőképessége ugyanakkor jelentősen meghaladja a fúziós partnerekét. így például a Streptomyces tenebrarius F 105 jelű törzs 2140 pgjnú nebramicin-2-, ^80 pg/ml nebramicin4- és 1510 /ug/ml nebramicin-5 -t, az F 88 jelű 0 /mg/ml nebramicin-2-t, 14Q jug/ml nebramicin4- et és 1440 /ug/ml r^ebramicin-5 -t, az F 77 jelű 840 /ug/ml nebramicin-5 -t, az F 104 jejű pedig igen kis mennyiségű (<1%) nebramicin-5 mellett 1520 /ug/ml nebramicin4-et bioszintetizál. A szülőtörzsekből előállított protoplasztok önfúziója után izolált törzsek termelőképessége nem változott. A Streptomyces tenebrarius F 104 jelű törzssel az 5. példában megadottak szerint eljárva 10 liter fermentlét állítottunk elő, majd lényegében a 174 315 számú magyar szabadalmi leírásban megadottak szerint izoláltuk a biológiailag aktív vegyületeket. Végtermékként 13,8 g nebramicin-5-öt (kanandcin-B) és 9 mg nebramicin-6-ot (tobramicin) kaptunk. Streptomyces tenebrarius F 77 és F 104 törzset MNG 00242, fll. MNG 00244 sorszámon letétbe helyeztük az Országos Közegészségügyi Intézet Nemzeti T örzsgyűj teményében. b) A 7-34 trp' és 73 lys' auxotróf törzsek fúziója Az ismert módon, mutagén kezeléssel, a Streptomyces tenebarius MNG 169 törzsből előállított Streptomyces tenebrarius 7-34 trp' triptofán igényű és 73 lys' lizin igényű törzsekből az 1. példában megadottakat megismételve protoplasztokat készítünk, a protoplasztokat fuzionáljuk és regeneráljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
