194306. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikum bioszintézis befolyásolására in vivo genetikai rekombinációval
1 194 306 2 charózt és lizozitn enzimet tartalmazó izoozmotikus oldatban szuszpendáljuk és protoplasztokat képzünk. A kapott protoplaszt-szuszpenzlót mossuk és a protoplasztok egy részét szerves szénforrást, nitrogénforrást, szacharózt, kalcium- és magnézium-ionokat és agart tartalmazó szilárd halmazállapotú regeneráló agarra szélesztjük. A protoplasztok másik részét 1 : 1 arányban keveijük olyan protoplasztokkal, amelyeket egy másik, a genetikai rekombinációhoz kiválasztott partner sejtjeiből készítettünk a fenti módon. A protoplasztok keveréséhez poli- etflén-gjikolt (Ms : 4000), valamint kalcium- és magnéziumionokra disszociáló sókat adunk, akkor a protoplasztok összeolvadnak (fúzió). Ezt követően regeneráljuk a sejteket. Ha a regenerálást minimal táptalajon végezzük, úgy csak a hibrid sejtekből képződnek telepek. Végezhetjük a regenerálást szerves nitrogénforrást tartalmazó táptalajon is. Ebben az esetben a kinőtt telepeket minimál táptalajra replikáivá állapítjuk meg a prototrófok számát. A fenti eljárás során két vagy több auxotróf törzsből készített protoplasztok fúzióját követően izoláltunk prototróf rekombinánsokat. Egyes antibiotikum termelő törzsek termelőképessege azonban auxotróffá alakításukkor erősen csökken. Ipari szempontból előnyös, ha a fúziós partnerek közül legalább az egyik nagymennyiségű antibiotikumot bioszintetizál. Ezért olyan eljárást dolgoztunk ki, amelynek során csak egy auxotróf törzset használunk, a másik fúziós partner pedig prototróf törzs, azonban ennek protoplasztjait a fúzió előtt kémiai vagy fizikai kezeléssel életképtelenné tesszünk. így a fúziót követően az auxotróf és az elpusztult, regenerálódásra és növekedésre képtelen prototróf sejtek közül csak a hibrid sejtek regenerálódnak, illetve fejlesztenek telepet. A protoplasztok inaktiválását kémiai vagy fizikai úton végezzük. Kémiai inaktiválószerként használhatunk bármilyen anyagot, amely a protoplasztokat integritásuk megsértése nélkül regenerálódásra képtelenné teszi, például — de nem limitáló jelleggel — kannabidiolsavat (3 -metfl-6-izopropenil A -n-pentfl-2”6 -dihidroxi-1,2,3,6-tetrahidro-difenil-3 -karbonsav) vagy sóit, N-etil-maleimidet, pirrolinitrint (3- 4dór-4-(3-klór-2-nitrofenfl)-pirrol), brillant-zöldet (N[4[[4-(dietilamino)-fenil]-feni]metilén]-2,5-ciklohexadién-l-ÍUdén]-N-etiletánaminium szulfát) és 2-merkapto-etanolt. A kémiai inaktiválás után a protoplasztokat mossuk, majd fúziós partnerként felhasználjuk. A találmány értelmében inaktiválhatjuk a protoplasztokat 7-sugárzással is. A 60Co izotóppal működő 7-sugárzóval 30-120 közötti, előnyösen 80 krad dózissal besugározzuk a protoplasztokat, majd centrifugálással összegyűjtjük és fúziós partnerként felhasználjuk. A kapott prototróf izolátumok antibiotikum termelőképességét vizsgáljuk. Ugyancsak meghatározzuk a fúziót követően kapott kettős auxotrófok és az ezekből szegregációval kapott prototrófok termelőképességét is. A törzsek termelőképességének ellenőrzésére előnyösen szerves szén- és nitrogénforrást, szervetlen sókat és növényi olajokat tartalmazó táptalajokat oltunk és inkubáljuk a tenyészeteket. 16-24 órajnúlva ugyancsak a fenti táptalaj-összetevőket tartalmazó, főfermentációs táptalajokat oltunk a növekvő sejteket tartalmazó lnokulumokkal, majd 140—160 órán át folytatjuk a tenyésztést. A tenyészetekből a 96. órától kezdődően, 24 óránként mintákat veszünk, és meghatározzuk antibiotikum-tartalmukat és a termelt antibiotikumok egymáshoz viszonyított arányát. A fenti módon előállított és antibiotikum termelés szempontjából előnyös egyedeket szerves szén- és nitrogénforrást, szervetlen sókat és növényi és/vagy állati olajokat és/vagy zsírokat tartalmazó táptalajon süllyesztett, levegőztetett körülmények között, 3/C és 40°C, előnyösen 37°C hőmérsékleten addig tenyésztjük, míg a táptalajban jelentős mennyiségű antibiotikum halmozódik fel. Rekombinánsok előállítására például a Streptomyces tenebrarius MNG 169 és MNG 204 sorszámú, az Országos Közegészségügyi Intézet Nemzeti Törzsgyűjteményében letétbe helyezett törzseket használhatjuk. Az MNG 169 jelű törzs nembramicin-2, nembramicin-4 és nebramicin-5 , az MNG 204 sorszámú pedig nyompyi mennyiségű nebramicin-4 mellett nebramicin-5 bioszintézisére képes. A törzsekből Ismert módon, N-metil-N -nitro-N-nitrozo-guanidines kezeléssel auxotróf mutánsokat állítunk elő. A mutánsok genetikai stabilitását több átoltást követően ellenőrizzük, ugyancsak ellenőrizzük antibiotikum termelőképességüket. A genetikailag stabil törzseket kiválasztjuk és a példákban megadott módon protoplasztokat állítunk elő. A protoplasztokat a megfelelő fúziós partnerekkel egyesítjük és regeneráljuk. Úgy találtuk, hogy mind a protoplasztképződés, mind a regenerálás közel 100%-os abban az esetben, ha a tenyésztést, a protoplasztokká alakítást és a regenerálást szacharóz valamint kalcium- és magnézium-ionokra disszociáló sók jelenlétében végezzük. A regenerálódott prototróf rekombinánsokat izoláljuk és ferdeagaron tenyésztjük. Megjegyezzük, hogy az auxtróf törzsekből spontán mutációval kisebb mint 10'* frekvenciával kapunk prototrófokat, míg a találmány szerinti fúziós technikával lxlO’3 —5x20'4 frekvenciával. Az izolált prototróf rekombinánsok termelőképességét vizsgálva úgy találtuk, hogy a szülőtörzsek által termelt antibiotikum-komplexben jelenlévő antibiotikumokat az egyes rekombinánsok az összes variációban termelik és a termelőképesség szintje is változott. A szülőtörzsek két (MNG 204), illetve három (MNG 169) nembramicin-komponenst termelnek. Ugyanakkor az MNG 204 és az MNG 169 protoplasztjainak önfúziójával vagy az MNG 204 és MNG 169 fúziójával létrehozott genetikai rekombinációs eseményeket követően olyan törzseket kapunk, amelyek ___ a) antibiotikumot nem, csökkent vagy a szülőkhöz viszonyítva megnövekedett mértékben bioszintetizálnák; b) egy nebramicin-komponenst : nebramicJn-2-î, nebramicIn-4-et vagy nebramicin-5 -t: c) két nebramicin-komponenst: nebramicin-2-t és nebr^micin-4-et, vagy nebramicin-2-t és nebraijiicin-5 -t vagy nebramicin-4-et és nebramicin-5 -t, és d) három r^ebramicin-komponenst : nebramicin-2-t, -4-et és -5 -t bioszintetizálnak. A kapott törzsek közül a nebramicln-2-t termelő Streptomyce tenebrarius 35TL jelűt MNG 00243 sorszámon, a nebramicin-4-et bioszintetizáló Streptomyces tenebrarius F104 jelűt MNG 00244 sorszámon, a nebramicin-5 -t termelő Streptomyces tenebrarius F77 jelűt pedig MNG 00242 sorszámon letétbe 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
