194305. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS szekvenciák, rekombináns DNS molekulák és humán interferon tipusú polipeptidek előállitására
1 194 305 2 a HuIFN-a In vivo és in vitro mind immunpotendáló, mind pedig immunszupresszív hatású lehet (Texas Reports, 357-69. o.) Megfigyelték, hogy specifikusan szenzlbilízált limfociták antigénnel való érintkezést követően HuIFN-a-t termelnek. Ily módon az antigén-indukálta HuIFN-a az immunválasz regulátora lehet, azaz egyrészt hat a keringő antigén szintekre, másrészt a celluláris Immunitást fejed ki (Texas Reports 370-74. o.). A HulFN növeli a bekebelező limfociták aktivitását és az antitest függő, sejt által szabályozott dtotoxlcitást [R. R. Herberman és társai, „Augmentation By Interferon Of Human Natural And _ Antibody Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity”, Nature, 277, 221-23. o. (1979) P. Beverly és D. Knight, „Killing ; Comes Naturally’, Nature 278, 119-20. o. (1979), . Texas Reports 375-80. o.)] is. E tényezők valószínűleg szerepet játszanak a tumor sejtek elleni immunológiai támadásban Is. Ezek alapján a HulFN, humán vírusellenes ágensként történő felhasználhatóságán kívül, potenciálisan tumor- és rákellenes terápiában is alkalmazható (The Interferon System, 319-21. o.). Ismert, hogy az interferonok számos állaton sokfajta tumor növekedését befolyásolják (The Interferon System 292— 304. o.). Hasonlóan egyéb antitumor ágensekhez leghatásosabbak a kis méretű tumorokkal szemben. Az állati IFN tumor-ellenes hatásai a dózistól és időtartamtól függnek, de a toxikus koncentrációknál alacsonyabb koncentrációkban hat. Az interferonok tumor- és rákellenes hatásait számos kísérletben és klinikai vizsgálatok során vizsgálták és vizsgálják így néhány rosszindulatú kórkép, mint példul oszteoszarkóma, akut mieloid leukémia, multiplex mielóma és Hodgkin-kór kezelésére (Texas Reports, 429-35. o.). Kimutatták továbbá, hogy melanoma és mellrák esetén a tumor-csomókba szubkután adott HulFN lokális tumor regressziót eredményezett [T. Nemoto és társai „Human Interferons And Intralesiqnal Therapy of Melanoma And Breast Carcinoma Amer. Assoc. For Cancer Research, Abs. 994, 246. o. (1979)]. Bár a klinikai próbák eredményei biztatóak, tumor- és rákellenes ágensként történő alkalmazásának komoly akadálya, hogy nem áll rendelkezésre kellő mennyiségű tisztított IFN. Jelenleg HuIFN-a két úton nyerhető, vagy humán sejtek szövetkultúrájából való tenyésztéssel, vagy pedig véradóktól gyűjtött humán leukociták révén. 800 1 Namalva sejt kultúrából 2,6xl09 NE-nyi nyers HuIFN-a-t kaptak (P. J. Bridgen és társai fenti közleménye). Az igen jelentős vérközpontok - mint például a Helsinkiben működő Finn Vöröskereszt Központ — évi kapacitása kb. 1011 NE-nyi nyers HuIFN-a, Minthogy azonban általában a napi dózis betegenként 3x10® NE, e források nem biztosítják a kívánt HuIFN-a mennyiségét. Ezért HuIFN-a előállítására egyéb módszerek is szükségesek. Mivel az IFN-a nagy fajlagos aktivitású - 4,0 x 10® és 10* NE/mg közötti -, kereskedelmi forgalmához kevés szükséges. Például 100 gram tiszta HuIFN-a 3-30 millió dózishoz elegendő. A molekuláris biológia fejlődése lehetővé tette, hogy specifikus nem-bakteriális eukarióta fehéijéket kódoló DNS-t baktérium sejtekbe építsenek be. Általában - nem kémiai szintézissel előállított DNS esetén — a rekombináns DNS felépítése a következő lépésekből áll: a kívánt fehérje tisztított hírvivő (messenger) RNS (mRNS) templátjának megfelelő egyláncú DNS másolat (cDNS) felépítése; ennek átalakítására kettősláncú DNS-sé; a DNS megfelelő klón-hordozó megfelelő részéhez való hozzákapcsolása, a rekombináns DNS megfelelő gazdaszervezetbe ültetése. E transzformáció után a gazdaszervezet a kívánt fehérjét fogja szintetizálni. E rekombináns DNS technikával E. coli-ban néhány nem-bakteriális fehérjét és gént sikerült előállítani, mint például patkány prezinzulin antigén faktorokat [L. Villa-Komaroff és társai „A Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin”, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 3727-31. o. (1978)], patkány növekedési hormont [P. H. Seeburg és társai, „Synthesis of Growth Hormone By Bakteria”, Nature, 276, 795- 98. o. (1978)], egér dihidrofolát-reduktázt [A. C. Y. Chang és társai, „Phenotypic Expression In E. Coli Of A DNA Sequence Coding For Mouse Dihydrofolate Reuctase ”, Nature, 275, 617-24. o. (1978)], humán szomatosztatint [K. Itakura és társai, „Expression In Escherichia coli Of A Chemically Synthesized Gene For The Hormone Somatostatin. . Science, 198, 1056-63. o. (1977)], európai szabadalmi leírásokban, 0,001,929, 0,001,930, 0,001,931 számon és más országbeli rokon bejelentésekben humán inzulin A és B láncát [D. V. Goeddel és társai, „Expression In Escherichia coli of Chemically Synthesized Genes For Human Insulin ”, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 106-10. o. (1979)], fenti európai és hasonló szabadalmi leírásokban, humán hepatitisz B vírus antigénjeit [C. J. Burrel és társai, „Expression In Escherichia coli, Of Hepatitis B Vírus DNA ^Sequences Cloned In Plasmid pBR322 , Nature, 279, 43—7 (1979) és M. Pasek és társai „Hepatitis B Virus Genes And Their Expression In E. coli”, Nature, 282, 575-79. o. (1979)], humán növekedési hormont [D. V. Goeddel és társai, „Egreket Expression In Escherichia coli Of A DNA Sequence Coding For Human Growth Hormone”, Nature, 281, 544-51. o. (1979)], SV40 t antigént [T. M. Roberts és társai „Synthesis of Simian Virus 40 t. Antigen In Escherichia coli”, Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 76, 5596-600 o. (1979)] és humán fibroplaszt interferont (HuIFN-j?) [T. Taniguchi és társai „Construction And Identification Of A Bacterial Plasmid Containing The Humah Fibroplaszt Interferon Gene Sequence ”, Proc. Japan Acad., 55, Ser. B. 464—69. o. (1979)]. A rekombináns DNS technikák közül azonban egyik sem irányul a HuIFN-a szintézisére. E probléma képezi a találmány tárgykörét. Amíg azonban a fenti rekombináns DNS eljárásokat megkönnyítette, hogy az előállítandó szintetikus gén szekvenciája ismert volt (pl. a szomatosztatin esetén) vagy rendelkezésre állt különleges DNS szekvenciában gazdag sejttípus vagy vírus (pl. hepatitisz vírus antigén esetén), vagy mRNS fajták (pl. patkány inzulin esetén), amelyek a kívánt hibrid DNS-t tartalmazó bakteriális kiónok előállítását és azonosítását lehetővé tették, vagy a kívánt fehérjét előállító E. coli gazdaszervezetek kiválasztását biztosító rendszer ismert volt, addig a találmány tárgyát képező probléma megoldását ilyen, hasonló ismeretek nem könnyítették meg. Nem jelent segítséget olyan plazmid, amelyről azt állítják, hogy olyan DNS szekvenciát tartalmaz, amely poli(A)RNS-től származó mRNS-hez hibrizálódik, amely mRNS HuIFN-0 aktivitást termel ooci-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
