194304. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immobilizált enzim aktivitásának szintentartására
1 194 304 2 Valamely kolonnát üzemeltetésre elkészítünk olymódon, hogy nagy tisztaságú oldható glükóz-izomerázt használunk a vivőanyag részleges terhelésére, illetve töltésére kezdetben és az ezt követő adagoláshoz. A kolonnában végzett műveletek ugyanazok, mint az 1. példa esetében annyiban, hogy a kukoricakeményítő-hidrolizátum átfolyási sebességét állandó értéken tartjuk és az oldható enzim a kristályos glükóz-oldatban történő betáplálását a beadagoló vezeték segítségével végezzük. Ilymódon a fruktózzá való átalakulását 40—44% értéken tartjuk 14 hétig. A betáplált 45%-os kukoricakeményítő hidrolizátum körülbelül 95% glükózt, 1,5 mmól MgS04-et és 2,0 mmól NaHS03-at tartalmaz. A betáplált anyag pH- ját 7,8 körüli értékre szabályozzuk, így a távozó termék pH-ja 7,5 lesz. Az immobilizált enzimágy hőmérsékletét 60 C°-on tartjuk. Oldható glükóz-izomeráz tisztítása Streptomyces rubiginosus fermentációs táptalajt extrahálunk avégett, hogy felszabadítsuk az oldható glükóz-izomerázt a sejtekből az 1. példában megadott módon azzal az eltéréssel, hogy a sejteket nem választhatjuk el a táptalajtól és az extrahálás előtt mossuk. Ezután egy 2350 ml-es adag szűrt kivonatot tisztítunk szemcsés DEAE-cellulóz kolonnán való frakcionálással. A szemcsés DEAE-cellulóz kolonna ugyanolyan anyagból áll, mint az immobilizált enzim részére alkalmazott vivőanyag az 1. példánál. A kolonna elkészítéséhez 300 g szárazanyagra számított GDC-t egyensúlyba hozunk 10 mmól Trispufferrel és a szuszpenziót egy 48 mm-es kromatografáló kolonnába töltjük egységes ágy készítése érdekében. A kolonnát 2 liter 10 mmólos Tris-pufferrel mossuk, ameddig a távozó termék pH-ja körülbelül 7 nem lesz. A 29,3 IGIU/ml-t tartalmazó enzim-oldatot az előkészített kolonnán lefelé folytatjuk 5 ml/perc átfolyási sebességgel. Az enzim bevitele után a kolonnát 3,5 liter 10 mmólos Tris-pufferrel készített 0,1 mólos NaCl-oldattal mossuk 7-es pH-n 10 ml/perc átfolyási sebesség mellett. A távozó termék enzimtartalmát frakciónként ultraibolya abszorpcióval és enzimpróbával mutatjuk ld. Azokat a frakciókat, amelyeknek nagyobb az IGIU/ml-tartalmuk 20-nál, 2. példa összegyűjtük (900 ml) és ultraszűréssel tisztítjuk. Az összegyűjtött frakciók ultraszűrését egy Amicon XM-100 membránnal végezzük egy Amicon 407 g Cellában keverés közben 0,7 105 Pa nitrogéngáz légkörben. Az ultraszűrőn visszamaradt anyag 800 IGlU/ml körülbelül 50%-os tisztaságú enzim. Vivőanyag immobilizáláshoz GDC vivőanyagot (7,75 g szárazanyag) bevi- 4Q szünk egy 1. pádéban leírt üvegkolonnába. A vivőanyagot tisztított enzimmel töltjük felvevőképességének körülbelül 25%-áig olymódon, hogy az oszlopon lefelé szivattyúzunk 50%-os kristályos glükóz-oldatot (pH = 7,8, 4 mmól MgS04, 5 mmól NaHS03), amely 136 ml 1/40-re hígított tisztított j5 enzimet (2720 IGIU) tartalmaz, 0,4-0,7 ml/perc átfolyási sebességgel. A távozó folyadékban nem volt kimutatható oldható enzim. A kristályos glükózoldat (pH = 7,8, 5 mmól MgS04, 5 mmól NaHS03) átfolyatását folytatjuk és a kolonna-köpenyt vízzel temperáljuk, olymódon, hogy a kolonnaágy hőmér- 20 séklete 60°C legyen. immobilizált aktivitás vizsgálata Az immobilizált aktivitást az 1. példában leírt módszerrel határozzuk meg. Az aktivitás mértéke Í686 IGIU volt, amely 62% adszorpciót képvisel. 25 Izomerizálás és enzimadagolás szabályos időközökben Kukoricakeményítő-hidrolizátumot vezetünk át immobolizált enzimágyon és az átfolyást úgy irányítjuk, hogy a fruktózzáalakulás 40—44% legyen. Az át__ folyási sebességet körülbelül 0,35 ml/perc állandó érféken tartjuk a kísérlet folyamán. Amint a fruktózszint csökken az enzim bomlása miatt, akkor körülbelül 20 ml 434 IGIU értékű hígított, tisztított oldható izomerázt adunk egy 50%-os kristályos glükózoldathoz (pH = 7,8,5 mmól MgS04, 5 mmól gg NaHS03 ) és az oldatot átszivattyúzzuk az ágyon körülbelül 0,4 ml/perc sebességgel. Adszorpció után a betápláló vezetéket visszacsatoljuk a kukoricakeményít-hidrolátumhoz. A II. táblázatban az izomerálás előrehaladását és az enzimadagolást foglaljuk össze. Miként az 1. példánál, úgy itt is állandó fruk- 40 tóz7.á történő átalakulást tartunk fenn állandó átfolyási sebességgel olymódon, hogy szabályos időközökben oldható izomerázt adagolunk. n. Táblázat Izomerizáció és enzimadagolás összefoglalása Hét Enzimadagolás IGIU Enzimfelhalmozózodás IGIU Átlagos fruktóz ■ % Felhalmozódó fruktóz g 43 % szárazanyag Enzimhatásosság IGIU/g 43 %-os szárazanyag 1 2720 ' 2720 33,5 1608 1,69 2 434 3154 413 3149 1,00 3 434 3588 42,9 4756 0,75 4 3588 43,6 6117 0,59 5 434 4022 42,3 8236 0,49 6 4022 43,1 9664 0,42 7 434 4456 41,6 11240 0,40 8 434 4890 41,0 12924 0,38 9 4890 41,9 ’ 14585 0,34 10. 434 5324 45,1 16366 0,33 11 5324 43,2 18152 0,29 12 434 5758 42,1 19535 0,29 13 5758 42,4 21108 0,27 14 5758 39,7 22624 0,25 6
