194304. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immobilizált enzim aktivitásának szintentartására
1 194 304 2 A találmány immobillzált enzim aktivitásának a szintentartására alkalmas eljárásra vonatkozik. A találmány tárgya közelebbről megjelölve eljárás valamely immobflizált enzim aktivitásának a kívánt szinten való tartására valamely folyamatos átalakítási eljárásban. Jóllehet protein immobflizálására már a korai 1920-as években találhatók utalások [Nelson, J. M. és D. 1. Hitchcocks, J. Amer. Chem. Soc. 46 : 1956 (1921)], beható érdeklődés azonban a jelenség iránt csupán a század utolsó negyedétől kezdve újult fel. Az immobilizáló módszerek négy általános osztályba sorolhatók: (1) megkötés (2) térhálósítás, (3) kovalens kapcsolás és (4) adszorpció. A megkötéses módszerek általában térhálósított gélekkel történő elzáráson vagy üreges szálakkal, Uposzóma makromolekulákkal és hasonlókkal való bekapszuláláson alapszanak. A térhálósítás az enzimek úgynevezett bi vagy multifunkciós térhálósító reagensekkel való módosítását foglalja magában, amelyet gyakran adszorpció vagy bekapszulázás követ. A kovalens kapcsolás a legszélesebb körben vizsgált módszer, amely az enzimnek valamely hordozóanyaghoz olyan funkciós csoportok segítségével történő kovalens kötését foglalja magában, amelyek nem lényegesek az enzim biológiai aktivitása szempontjából. Az adszorpció az enzimnek valamely adszorbenshez való egyszerű érintkeztetésével létrejött folyamat, amelynél az immobilizálás az enzim és az adszorbens közötti viszonylag gyenge kötőerők egymás közötti hatásából adódik. Az immobilizálásnak ez az utóbbi módszere az, amely közvetlen rokonságban van a találmánnyal, ezért az adszorpció egyes elveit az alábbiakban bővebben kifejtjük. A megkötés, a térhálósítás és a kovalens kapcsolás széleskörű vizsgálata folyik, amelyet például a Weetal, H. H., ed. „Immob^zed Enzymes, Antigens, Antibodies and Peptides M. Dekker, New York, (1,975) vagy Zaborsky O. R. „Immobilized Enzymes” CRS Press, Cleveland (1973) irodalmi helyek ismertetnek. Az adszorpcióra vonatkozó korai kimutatások azt mutatták, hogy bizonyos esetekben az adszorpció az enzim részletes vagy teljes inaktiválásához vezetett. Ennélfogva úgy véljük, hogy valamely alkalmas adszorbens a találmány szerinti gyakorlat számára az, amelynek viszonylag nagy az affinitása az enzimhez, de még csak kis mértékű az inaktiválása. Az adszorpciós Immobilizálás alumíniumklorid, bentonlt, kalcium-karbonát, cellulóz, kollagén, ioncserélő gyanta, kaUnlt, Sephadex, szilikagél és titánnal bevont saválló acél hordozóanyagokkal ismert. Ahogy később ismertetjük, a találmány szerinti eljárás az adszorbeált enzim-rendszerek széles körénél alkalmazható, de különösen alkalmas immobflizált glukóz-Izomerázt használó folyamatok javítására. A legtöbb fruktózt iparilag (keményítőből származó) glükóz fruktózzá való izomerizálásával állítják elő valamely alkalmas reaktorban, amelynek során glükóz-oldatot vezetnek át immobflizált glukóz-izomeráz-ágyon. A távozó termékfolyadék fruktóztartalmát jellegzetesen állandó szinten, például 40-44%-on tartják a reaktoron való átfolyási sebesség szabályozásával. Mihelyt az immobflizált enzim természetes módon bomlik hő hatására és kémiai anyagok okozta inaktiválódás folytán, az átfolyási sebességet szabályos időközökben csökkentik. Abban az esetben, ha az átfolyási sebesség azt az értéket éri el; amelynél további csökkentés nem kedvező, akkor az immobflizált enzimet új immobflizált enzimággyal helyettesítik. Mivel valamely kolonna átfolyási sebessége annak élettartama alatt változhat, például 50 GPM-től 5 GPM-ig, számos kolonnát kell üzemeltetni közelítően állandó termelési sebesség elérésére. Különösen használható rendszerek vannak leírva gjukóz-izomeráz immobflizálására a 3,788.945, a 3,909.345, a 4,110.164, a 4,168.250 és a 4,355.117 számú USA-beli szabadalmi leírásokban. A 3,960. 663 számú USA-beli szabadalmi leírásban ismertetett megoldás szerint oldható glukóz-Izomerázt adnak szabályos időközökben a betáplált glükózárammal együtt az izomerizáló reaktorba, amely immobflizájt glukóz-izomerázt tartalmaz. A glukóz-izomerázt valamely erős bázisú anioncserélő gyantán immobilizálják, amely felvevőképességéig van töltve oldható glukóz-izomerázzal. Mihelyt az enzim bomlik, adszorpciós tulajdonságai megváltoznak, így az inaktív enzim leválik a hordozóanyagról és megjelenik a távozó folyékony termékben. E szabadalom szerint az elbomlott enzimet úgy helyettesítik, hogy a hordozóanyagot friss enzimmel érintkeztetik olyan mennyiségben, amennyi elegendő a hordozóanyag teljes újratöltéséhez. Mivel a kimerült enzim folyamatosan válik az adszorbensről, a távozó folyékony terméket további lépésben tisztítani kell a szennyező enzim eltávolítása érdekében. A találmány szerinti eljárás jelentős előnyökkel rendelkezik a hagyományos megoldásokhoz viszonyítva, mivel: (1) a műveletek egyszerűsítését teszi lehetővé - megszüntethető a reaktoráramok szabályos időközökben történő beállítása; (2) csökkenthető a beruházás nagysága — kisebb reaktorokra van szükség néhány nagy reaktorral szemben, így megszüntethető az átfolyási sebesség Ingadozása; (3) javítható a termelés szabályozása, illetve ellenőrzése - nagyobb fruktóz-szinteket lehet elérni anélkül, hogy szükség lenne az átfolyási sebesség csökkentésére több oldható enzimnek a reaktorba való adagolásával, és (4) csökkenthetők a termék flnomítási költségei - mivel a nagyon lassú átfolyási sebességek és ennélfogva a hosszú tartózkodási idők megszüntethetők, így kisebb mértékű az elszíneződés és a szagképződés. A találmány tárgya tehát eljárás valamely immobilizált enzim állandó aktivitásának a fenntartására valamely reaktorban, amelynek során szilárd hordozóanyagon az adszorpció körülményei között az enzim olyan mennyiségét adszorbeáljuk, amely az aktivitás előre meghatározott szintjét képviseli és ez kevesebb a hordozóanyag legnagyobb felvevőképességénél, majd további enzimmennyiségeket adszorbeálunk a hordozón az előre meghatározott aktivitás fenntartására, mihelyt az előzőleg adszorbeált enzim aktivitása az előre meghatározott szint alá csökken. Az enzim szabályos időközökben való adagolását addig folytatjuk, ameddig a hordozóanyag legnagyobb felvevőképességét el nem érjük. A találmány szerinti eljárás jól felhasználható arra, hogy fenntartsuk valamely glukóz-izomeráz reakcióképességét, Így felhasználhatjuk fruktóznak glukózból való előállítására. Valamely immobflizált enzimes eljárás hatásossá5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
