194303. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleozid-trifoszfát függő 1-metil-hidantoináz előállítására, valamint eljárás és reagens kreatinin meghatározására
1-hldantoin oldatok. **• Megjegyzés: Amennyiben az 1-metil-hidantoináz készítmény még számottevő mennyiségű ATP-ázt vagy NADH-oxjdázt tartalmaz, ami az l-metll hidantoináz oldat hozzáadása után jelentős NADH-fogyásban jelentkezik a reakcióelegy-vakérték elegyben, az E2>m és E2 EV értékeket pontosan egyenlő időközökben kell mérni az NMH-áz hozzákeverése után (például 6 perc múlva). A mért extinkciókülönbségek (AE) és a mintában lévő 1-metn hidantoin mindenkori koncentrációja közötti összefüggést a 4. ábrában ábrázoljuk: az 1-metil-hjdantoin hidrolízisekor keletkező ADP-mennyiségnek a NADH moláris extfnkciós koefficiensein át 365 nm-nél való számításából az ATP-felhasználás illetve az ADP-képződés reakciósztöchiometriájára az 1-metil-hldantoin-hidrolizísre vonatkoztatva 1 : 1 adódik (lásd 5. ábra). 8. példa Enzimatikus színteszt kreatinin meghatározására. 8.1 Reagens: Megfelel az 5. példában leírt 1.1 reagensnek 2 egység/ml (végkoncentráció) kreatinin-iminohidroláz hozzáadásával. 8.2 A meghatározás kivitelezése: Az 5. példa 1.2 pontjának megfelelően, azonban mintaként 87,7 -1754 jtmól/llter koncentrációjú kreatinin oldatokat használunk, és a minta és reagensvakérték esetében az inkubációs időt 20 percre meghosszabbítjuk. A AE értéknek a mintában lévő kreatinin-koncentrációtól való függését a 6. ábrán mutatjuk be. Amennyiben a 8.1 reagensből elhagyjuk a kreatinln-iminohjdrolázt, úgy semmilyen színreakciót nem észlelünk, ugyanígy ha a 8.2 tesztelegyben a kreatinin oldatok helyett 884 /^mól/liter koncentrációjú kreatin oldatot használunk mintaként. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás nukleozid-trifoszfát-függő 1-metil-hidantoináz, amelynek molekulasúlya körülbelül 125.000 (SDS gradiens-gélelektroforézis), pH-optimuma 7,8 pH-ná] van, KM-értéke 1-metil-hidantoinra 0,02 mmól/liter és ATP-re 0,8 inmól/liter, előállítására, azzal jellemezve, hogy Arthrobacter spec. DSM 2563-t, DSM 2564-t, Moraxella spec. 2562-t, Micrococcus spec. DSM 2565-t vagy Brevibacterium spec. DSM 2843-t tenyésztünk, és az enzimet izoláljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jel- 1 e m e z v e, hogy az enzim izolálásához a mikroorganizmust feltárjuk, az enzimet polietiléniminnel lecsapjuk és adott esetben ammónium-szulfátos frakdonálással, hőkezeléssel és kromatográ fiával tisztítjuk. 3. Eljárás kreatinin meghatározására a kreatinin kreatinin-dezimináz E. C. 3.5.4.21-gyel 1-metil-hidantoinná való átalakításával, azzal jelleme zv e, hogy az 1 -metil-hidantoint 1-metil-hjdantoinázzal nuldeozid-trifoszfát és valamilyen többértékű fémion jelenlétében és kívánt esetben valamilyen ammónlumsó jelenlétében hidrollzáljuk, és a) az 1-metŰ-bldantoinból keletkezett hldroli-2 zisterméket N-karbamofl-szarkozin-amidohidrolázzal reagáhatjuk szarkozin képződése közben és a szarkozlnt szarkozin-oxidáz vagy szarkozin-dehidrogenáz segítségével meglratározzuk vagy b) az egyidejűleg keletkezett nuldeozid-difoszfátot meghatáTOzzzuk. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a meghatározást valamilyen pufferolt vizes oldatban 7,0 és 9,0 közötti pH-értéken hajtjuk végre. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 7,3 és 8,5 közötti pH-értéken reagál tatunk. 6. A 3-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót 10 és 500 mmól/liter közötti pufferkoncentrációnál végezzük. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 50 és 200 mmól/liter közötti pufferkoncentrációt állítunk be. 8. A 3-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nukleozid-trifoszfátként ATP-t alkalmazunk. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,05-50 mmól/liter ATP-t hasz nálunk. 10. A 3-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy többértékfl fémionokként magnézium- vagy mangánionokat alkalmazunk. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a magnéziumionokat magnézlum-(Il)-klorid, magnézium(II)-szulfát vagy magnézium(Il)-aszpartát formájában alkalmazzuk. 12. A 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,1-50 mmól/liter kétvegyértékű fémiont használunk. 13. A 3-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,01-10 egység/ml 1-metil-hidantoinázt használunk. 14. 3-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,1-100 mmól/ liter ammóniumsót használunk. 15. A 3-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,1-20 egység/ml N-karbamoil-szarkozin-amidohidrolázt használunk. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 1-20 egység/ml szarkozinoxidázt vagy szarkozin-dehidrogenázt használunk. 17. Reagensek kreatinin meghatározására, azzal jellemezve, hogy 0,1-20 egység/ml kreatinin-deziminázt, 0,01—10 egység/liter 1-metil-hidantoinázt, 0,05—50 mmól/liter ATP-t vagy GTP-t, 0,1—50 mmól/liter kétvegyértékű fémionokat és 10-500 mmól/liter 7,0-9,0 pH-jú pufferanyagot, valamint a) 0,1-20 egység/ml N-karbamoil-szarkozin-amido-hidrolázt, 1-20 egység/liter szarkozin oxidázt vagy szarkozin-dehidrogenázt és adott esetben hldrogén-peroxid vagy formaldehid meghatározására szolgáló valamilyen rendszert vagy a szarkozin-hldrogénáz-reakció közvetlen láthatóvá tételére szolgáló valamilyen színképző elektron-akceptor-rendszert tartalmaznak vagy 194 303 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
