194303. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleozid-trifoszfát függő 1-metil-hidantoináz előállítására, valamint eljárás és reagens kreatinin meghatározására
1 194 303 2 1.0 mg nlkotinamid, 1.0 mg fólsav, 10,0 mg tiamin-hidroklorid, oldva 100 ml kétszer desztillált vízben és sterilre 5 szűrve. Az oldatból 1 ml-t adunk 1 liter táptalajhoz. 10 ml folyékony, előbb leírt táptalajt beoltunk 1 kacsnyj ferda agárról vett anyaggal, és 100 ml-es Erlenmeyer lombikban 28°C-on 20—24 óra hosszat rázatjuk. Utána ezt a 10 ml-t (1. előtenyészet) 1000 ”10 ml ugyanilyen táptalajra visszük át, és 200 ml-es részletekre osztva 1 literes Erlenmeyer lombikokban 28°C-on további 24 óra hosszat rázatjuk. (OD 1 :20 = 0,425). Ezt a 2. előtenyészetet utána 100 liter ugyanilyen táptalajhoz oltjuk egy fermentorba, és ..g 28t>C-on 18 óra hosszat fermentáljuk. 0 A maximális enzimszintézis a növekedés végén (késői log-fázis) van. Az előbb leírt adagból 1180 g nedves masszát nyerünk, 100 egység/liter NMH-áz (1-metil-hidantoináz) és 160 egység/liter CSH-áz (N-karbamoil-szarkozin-amidohidroláz) aktivitással. 20 B) Az enzim izolálása és tisztítása. 280 g Arthrobacter nedves masszából (=20 liter tenyészet) 500 egység NMH-ázt izolálunk: Művelet Térfogat (ml) Lizozimos feltárás 20%-os glicerinben 1400 Polietilénimin-lecsapás csapadék 430 Ammónium-szulfátos frakcionális = csapadék 120 50°C-ra melegítés pH 8-on, felüTúszó 90 Feníl-Sepharose krotográfia eluátuma bepárlás után 60 DEAE-Sephacel krotográfia 8 Molekulaszűrős frakcionálás, Sephacryl S200 10 Egység egy- Kiterség/mg mêlés pro- % tein 25 1600 0,06 100 1586-99 30 1181 0,04 73 934. 0,67 58 35 830 1,20 52 553 1,40 35 40 492 2,20 30,7 45 Végső preparátum adatai: 22,3 egység/ml, 10,5 mg/ml, 2,1 egység/mg protein, 50%-os glicerin, 50 mmól/liter TRIS, pH = 8,3. Az aktivitás meghatározást a következőképpen vé- gQ gezzük: 1. Szinreagens** Komponensek Koncentráció TES : KOH puffer (pH 7,8) 162 mmól/liter 4-amíno-antipirin 0,81 mmól/liter 2,4,6-tribróm-3-hidroxi- 55 benzoesav 8,1 mmól/liter Magnézium-klorid 8,1 mmól/liter ATP 4,3 mmól/liter Ammónlum-szulfát 32 mmól/liter CSH-áz 1,1 egység/liter Szarkozin-oxidáz 6,5 egység/liter 60 Peroxidáz 2,7 egység/liter 2. 1-Metil-hidantoin oldat 10 mmól/liter. 3. A meghatározás kivitelezése: Hullámhossz 546 nm: T = 25°C, rétegvastagság 1 cm: térfogat 2,03 ml, a képződött színezék extinkció koefficiense = 13 cm1 //imól, Küvettába pipettázni Színreagens ( 1 ) 1,88 ml Minta* 0,05 ml összekeverni, megvárni amíg adott esetben a mintában lévő szarkozin és N-karbamoü-szarkozin elreagál, utána hozzáadni. 1-Metfl-hidantóin oldat (2) 0,10ml összekeverni, extinkciónövekedést nyomonkövetni, és AE/perc értéket meghatározni a lineáris tartományból. * (Mintaanyag: A nyersextraktum meghatározásához a 20 mmól/liter TRIS . HCl-t (pH 8,0) valamint 0,1% Triton X-100-at tartalmazó 20%-os glicerinben ultrahanggal feltárt mikroorganizmusok nagy fordulatszámon centrifugált felülúszóját használjuk. ** A pH-optimum (lásd 5. oldal 2. pont), a szubsztrátspecifitás (lásd 8. oldal 3.b pont) valamint a fémionok, aktivátorok és Inhibitorok (lásd 8. és 9. oldal 4., 5. és 6. pont) vizsgálata esetében értelemszerűen vagy a megfelelő anyagok koncentrációját vagy a hozzáadott anyagok fajtáját változtatjuk. 4. Számítás egység/ml minta = ^/peic * ^,03 x adott esetben ’ végzett mintahígítás) Megjegyzés: AE/perc nem lehet nagyobb 0,06-nál: ellenkező esetben a mintát hígítani kell. Lag-fázis körülbelül 5 perc. 2. példa Moraxella spec. DSM 2562-t (amelyet egy szarvasmarhaistálló-mintából izoláltunk) az 1. példában leírt összetételű ferde agaron tartunk, és ugyanabban a táptalajban tenyésztjük, mint az Arthrobacter speciest. Előtenyészet: 20 ml NMH-táptalajt (amely azonos az 1. példa szerintivel) egy 100 ml-es Erlenmeyer lombikban ferde agárról beoltunk, és 28°C-on 21 óra hosszat rázatjuk. (OD 1 :20 = 0,430). Főtenyészet: Egy 2 literes Erlenmeyer lombikban lévő 400 ml az 1. példában megadottal azonos NMH-táptalajt beoltunk 8 ml előtenyészettel, és 28°C-on 43 óra hosszat tenyésztjük rázatás közben. Az ultarhanggál feltárt biomasszában a következő aktivitásokat mérjük: Tenyészidő OD 1 :20 NMH-áz (óra) egység/liter 24 0,415 41 28 0,495 72 39 0,730 57 6
