194303. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleozid-trifoszfát függő 1-metil-hidantoináz előállítására, valamint eljárás és reagens kreatinin meghatározására
1 194 303 2 A találmány szerinti enzim enzimek tisztítására önmagukban ismert módszerekkel nyerhető ki olyan mikroorganizmusokból, amelyek feldolgozásra érdemes mennyiségben tartalmaznak 1-metil-hidantoinázt. Célszerűen a mikroorganizmust feltáljuk, és az enzimet polietilénimln hozzáadásával kicsapjuk. így olyan enziinmészítményt kapunk, amely már analitikai célokra alkalmazható. Amennyiben további tisztítás kívánatos, úgy célszerűen ammónium-szulfátos frakcionálási, hőkezelési műveletet, valamint kromatográfiát alkalmazunk. A mikroorganizmus-feltárás ismert kémiai vagy fizikai módszerekkel történhet, például kémiailag lizozim segítségével vagy fizikailag ultrahanggal, dezintegrálássa! nagynyomású szuszpenzióban és hasonlókkal. A feltárád eljárás nem döntő. Különösen alkalmasak azonban az olyan módszerek, amelyek a sejtmembránt messzemenően feloldják. A hőkezelési művelet célszerűen 50°C-on történik olyan pH tartományban, amelyben az enzim jó stabilitást mutat. A kromatográfiás tisztításra különösen fenil- Sepharose és DEAE-csoportokat tartalmazó gyengén bázisos anjoncserélők váltak be. Előnyös tisztítási eljárás a következő: lizozimos feltárás 20%-os glicerinben, lecsapás oldható polietilénimin hozzáadásával, a csapadék kinyerése, ammónium-szulfátos frakcionálás, hőkezelés 50°C-on és pH 8-on, kromatografálás fenil-Sepharose-on, ezt követően kromatográfia DEAE-Sephacel -en és végül molekulaszűrős frakcionálás, célszerűen SephacryFö 200-on. Dymódon olyan tiszta enzimkészítményt kapunk, amelynek fajlagos aktivitása 2,1 egység/mg protein, és amelyen az enzim tulajdonságai meghatározhatók. Az enzim kinyeréséhez használható mikroorganizmusokat célszerűen olyan táptalajon tenyésztjük, amely szén- és nitrogén-forrásként 1-metil-hidantoint tartalmaz vitaminok és nyomelemek mellett. A jelen találmány tárgya továbbá eljárás kreatlnin vizes, pufferolt oldatban való meghatározására a kreatininnek kreatinin-dezimináz E. C. 3.5.4.21-gyel 1-metfl-hidantionná való átalakításával. A találmány szerinti megoldást az jellemzi, hogy az 1-metil-hidantoint 1-metil-hidantoinázzaJ előnyösen feleslegben lévő nukleozid-trifoszfát és valamilyen többértékű fémion jelenlétében hidrolizáljuk, és a) az 1-metil-hidantoinból keletkezett hidrolízisterméket N-karbamofl-szarkozln-amidohidrolázzal reagáltatjuk, szarkozik képződése közben és a szarkozint szarkozin-oxidáz- vagy szarkozjn-dehidrogenáz segítségével kimutatjuk, vagy b) az egyidejűleg képződött nukleozid-difoszfátot meghatározzuk. A keletkező hidrolízistermék reakciósebesség és mérési jel nagysága szempontjából az N-k írbamoflszarkozin-amidohidrolázzal kapcsolt indikátorreakcióban gyakorlatilag pontosan úgy viselkedik, mint a reakcióelegyhez 1 -metil-hidantoin helyett ekvimoláris mennyiségben hozzáadott N-karbamofl-szarkozin. (Lásd 2. és 3. ábrát is.) A pufferolt vizes oldat pH-ja célszerűen 7,0 és 9,0 között, előnyösen 7,3 és 8,5 között, különösen 7,5 és 8,2 között van. A pH-érték beállítása céljából olyan anyagok jönnek számításba, amelyek az említett pH-tartományban kielégítő pufferkapacitással rendelkeznek, így például foszfátok, TRIS, trietanol■amin vagy TES. Különösen előnyös a TES-puffer. A púffer koncentrációja rendesen 10 és 500 mmól/ 1 között van, előnyösen 50 és 200 mmól/1 között, különösen 75 és 125 mmól/1 között van. Nukleozid-trifoszfátként ATP vagy GTP jön számításban, előnyösen ATP. A koncentrációtartomány célszerűen 0,05 és 50 mmól/liter közé, előnyösen 0,5 és 20 mmól/liter közé, különösen előnyös 1 és 10 mmól/liter közé esik. Többértékű fémionokként előnyösen kétvegyértékű fémionokat alkalmazunk, különösen előnyösen magnézium(II)- és mangán(II)-ionokat, főleg magnézium(II)-ionokat vízoldható sóik formájában, például magnézium(II)-ionokat vízoldható sóik formájában, például magnézium(II)-kloridot vagy magnézium(II)-szulfátot vagy magnézium(II)-aszpartátot is. A fémionok koncentrációja célszerűen 0,1 és 50 mmól/liter közé, előnyösen 0,5 és 20 mmól/liter közé, különösen előnyösen 1 és 10 mmól/liter közé esik. A reakcióelegyhez milliliterenként rendesen 0,0 \ és 10 egység közötti, különösen 0,05 és 2 egység közötti, előnyösen 0,1 — 1 egység 1-metil-hidantoinázt adunk. Az 1-metil-hidantoináz aktjvitásnövelésére ammóniumsó-adalékok bizonyultak kedvezőnek: a koncentrációk 0,1 és 100 mmól/liter közöttiek, előnyösen 1 és 30 mmól/liter közöttiek, különösen 5 és 10 mmól/liter közöttiek. A kreatinin-iminohidrolázt célszerűen 0,1-20 egység/ml, előnyösen 0,05-15 egység/ml, különösen 1 — 1.0 egység/ml mennyiségben használjuk. Az N-karbamoil-szarkozin-arrüdohídroláz esetében 0,1-20 egység/ml aktivitáskoncentrációk kedvezők, 0,5—10 egység/ml aktivitáskoncentrációk előnyösek, de leginkább az 1-5 egység/m] közötti koncentrációk. Általában a 3248145 sz. német szövetségi köztársaságbeli közzételi irat adatai megfelelők. A szarkozin-oxidáz esetében a kedvező tartomány 1-20 egység/ml, előnyös a 2-10 egység/ml, különösen előnyös a 4-8 egység/ml. Ugyanez érvényes a hasonlóképp alkalmazható szarkozin-dehidrogenázra. A szarkozin szarkozin-oxidázzal vagy szarkozindehidrogenázzal való kimutatása ismert, és az erre megadott és .a szakember által ismert körülmények a találmány keretén belül is megfelelők. Ugyanez érvényes a keletkező nukleoizid-difoszfátok, tehát az ADP vagy GDP kimutatására is. Erre is alkalmazhatók az ismert eljárások illetve reagensek. A keletkezett szarkozin kimutatására az ismert szarkozin-oxldáz-reakció alkalmazása különösen előnyös. A szarkozin-oxidáció lefutása vagy elektrokémiallag az oxigén-felhasználáson vagy a reakcióelegyben keletkező hidrogén-peroxidon át követhető, vagy enzimatikusan a hidrogén-peroxid vagy formaldehid képződésen át. Különösen előnyös a hidrogénperoxid meghatározását fotometriásan végezni, mégpedig valamilyen peroxidáz-katalizált színreakcióban 2,4,6-tribróm-3-hidroxi-benzoesav 4-amino-antipirinnel való oxidativ kapcsolásán át. A peroxidáz-aktivitás itt 0,05-20 egység/ml, előnyösen 0,2—10 egység/ ml, különösen 0,5—5 egység/ml. A tribróm-hidroxi-benzoesavat 1-25 mmól/liter, előnyösen 2—20 mmól/liter, különösen 5-10 mmól/liter koncentrációban alkalmazzuk. A 4-amino-antipirin esetében 0,1-2 mmól/liter előnyösen 0,2-1,5 mmól/liter, különösen 0,5—1 mmól/liter koncentráció bizonyult megfelelőnek. Más ismert rendszerek is ugyanígy alkalmazhatók hidrogén-peroxid vagy más módszer szerint formaldehid ldmutatására. Mivel az 1-metfl-hidantoináz nukleozid-trifoszfá-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
