194302. lajstromszámú szabadalom • Új lemeztáptalaj és eljárás szalmonella speciesek hatékonyabb izolálására
1 194 302 2 5. az agar tisztított poragar, előnyösen Bacto agar (Difco) 6. a cukor előnyösen analitikai minőségű szacharóz vagy glükóz 8. a bríllantzöld Merk 9. a magnézium-klorid analitikai minőségű 10. és a neutrálvörös Chroma minőségű A találmány az említett összetételű lemezek előállítására Is kiteljed, amit az jellemez, hogy a komponeseket - adott esetben csoportosítva — desztilláltvízben oldjuk, sterflezzük, majd melegen kiöntjük. A találmány tárgyát képezi továbbá a Salmonella izolálására szolgáló eljárás is, amelyet az jellemez, hogy a fentiek szerinti lemeztáptalajra egy adott szélesztéssel oltunk és a táptalajt 43°C-on, majd ennél alacsonyabb hőmérsékleten, előnyösen 37°C-oninkubáljuk. A táptalajt pl. a következőkben állíthatjuk elő: a) Alaptáptaíaj-oldat: 3.0 g Lab-Lemcot, 5,0 g triptont, 0,5 gNa2HP04- et és 1,0 g Yeast extractot, valamint 13 g Bacto agart literes táptalaj üvegbe mérünk, majd desztillált vízzel 1 literre feltöltjük. A komponenseket jól összekeveijük, melegítéssel feloldjuk, majd 1 MPa nyomáson 15 percig autoklávban 121°C-on sterflezzük. A kész oldat pH-ját híg NaOH-oldat hozzáadásával 7,6-ra állítjuk be. b) Keverékoldat: 6.0 ml 0,5%-os vizes bfllantzöld-oldatot, 6,0 ml 0,5%-os vizes neutrálvörös-oldatot, 33,0 ml 10%-os steril cukoroldatot és a magnézium-klorid fenti mennyiségéhez szükséges, a törzsoldat töménységétől függő mennyiségű MgCl2 -oldatot 100 mi re egészítünk ki steril desztillált vízzel és a komponenseket alaposan összekeverjük. A cukoroldatot pl. 3,0 g szacharóz, 0,3 g glükóz 33 ml desztillált vízben való oldásával készítjük, és a kész oldatot baktériumvisszatartó szűrőn steril edénybe szűrjük. A magnézium-kloridból higroszkópossága miatt közvetlen beméréssel meghatározott koncentrációjú oldat nem állítható elő, ezért célszerűen töményebb törzsoldatot készítünk, amelynek precizíósan mért fajsúlya pl. 1,25 körüli 25°C-on, majd ebből adagolunk — töménysége függvényében, annyit, hogy a táptalaj fentiekben megadott magnézium-klorid mennyiségét biztosítsuk. A magnézium-klorid oldatot baktériumvisszatartó szűrőn steril edénybe szűrjük. c) Lemeztáptalaj készítése 900 ml alaptáptalajhoz 100 ml keverékoldatot adunk éspedig úgy, hogy előzőleg mindkét oldatot 50°C-ra melegítjük, az alaptáptalajhoz hozzáadjuk a keverékoldatot, majd alaposan összekeverjük. A kész táptalaj pH-értéke 7,0—7,2. Az így készített táptalajból lemezeket öntünk, 1 literből kb. 50 lemez állítható elő. Ezek a lemezek hűtőszekrényben tárolva néhány napig felhasználhatók é§ ha légmentes zárást biztosítunk (pl. fóliában lehegesztünk 10— 10 db-ot), úgy több hétig is felhasználható. A táptalaj lemezeket előnyösen 43°C-on 13—14 órán át, ezt követően célszerűen 37°C-on inkubáljuk. Ilyen kezelés után a lemezek azonnal értékelhetők. Úgy is eljárhatunk azonban, hogy a lemezeket 43*>C-on végzett inkubálás után szobahőmérsékleten tartjuk, ekkor azonban legalább 4 órán át kell így tárolni, a Salmonella telepek kellő kifejlődése érdekében, ezután végezhetjük az értékelést. Az értékelést követően a szokásos módon végezzük az azonosítást szolgáló leoltásokat, biokémiai és szexológiai vizsgálatok céljából. Vonatkozó, igen kiterjedt vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a találmányunk szerinti táptalaj rendkívül szelektív, az Enterobakteriaceae családhoz tartozó genuszok közül csak a Salmonella tenyészik a lemezen, a többi genusz gyakorlatilag nem növekedik rajta. Így a legfontosabbak közül nem tenyészik az E. coli, a Klebsiella, a Proteus, az Enterobacter, továbbá a P. aeruginosa sem, amely nem bélbaktérium, de gyakori kísérő flóra és riiint ilyen, a Salmonella izolálásánál sok problémát okoz az ismert táptalaj-lemezek, illetve módszerek alkalmazása esetén. A találmány szerinti lemezeken nem tenyésznek a bélbaktériumokhoz tartozó Gram-negatív flórán kívül a Gram-pozitív flóra tagjai sem. A bélbaktériumokat a legnagyobb számban tartalmazó széklet vizsgálatát a találmány szerinti megoldással közvetlen, vagyis direkt leoltással is eredményesen végezhetjük. Ha a vizsgált anyagban Salmonella van jelen, akkor csak ennek a baktérium telepei fognak kinőni, s ezeket meg is számlálhatjuk. Előnyös, ha a lemeztáptalaj differenciáló cukorként kizárólag szacharózt tartalmaz, ekkor ugyanis a III. Subgenusba sorolt Salmonella arizonae - amely laktózt tartalmazó ismert táptalaj lemezeken nem ismerhető fel —, ugyanúgy kimutatható. A találmány szerinti táptalajlemezeken a kvalitatív értékelésen kívül lehetőség van a Salmonella telepek megszámlálására és a Salmonella koncentrációjának nagyságrendi megadására is. A táptalaj eredményesen használható a közegészségügyi-járványügyi tevékenység területén az enterális-, a víz-, szennyvíz- és az élelmiszer-mikrobiológiai munkában. A vizsgálati eredményeket gyorsabban és biztonságosabban kapjuk meg akár pozitív, akár negatív eredményről van szó. A leoltásra elkészített lemeztáptalaj teljesen átlátszó, halvány, leginkább ó-arany színre emlékeztető. A Salmonella telepek az inkubálás után jellegzetes telepalakulást mutatnak. A megszokottnál kisebb, sárga színű, kerek, éles szélű, átnézetben áttűnő Salmonella telepnek a középpontja kissé tömöttebb és itt egy rózsaszínű elszíneződés jön létre, amely szín később, órák múlva megerősödik. A lemeztáptalajban lévő egyedi komponensek mind ismertek és ezek eddig is használatosak voltak a mikrobiológiában. Ez a táptalaj az eddig ismert és Salmonella izolálásra használatos lemeztáptalajokkal szemben azzal tűnt ki, hogy szelektivitás tekintetében messze felülmúlja azokat. Ezt a különleges hatékonyságot azzal éljük el, hogy a megszokottól eltérő mennyiségben használunk egyedi komponenseket, továbbá eddig soha nem szereplő hatóanyag párosításokat alkalmazunk. Előnyös, ha a vizsgálati anyagnak a táptalajra való leoltását speciális, meghatározott módon végezzük, továbbá a leoltott lemezeket 37°C helyett 43°C hőmérsékleten inkubáljuk. Az alaptáptalaj, ennek összetétele teszi lehetővé azt, hogy a lemezen a leoltott bélbaktériumok telepei kialakulhassanak, beleértve természetesen a Salmonellát is. Ezen tehát az összes bélbaktérium egyformán jól tenyészik. A brillantzöld festék egy nagyhatású, általános biológiai sejtméreg. A táptalajunk ezt az anyagot a mikrobiológiában szokásos koncentrációt, mintegy hatszorosan meghaladó mennyiségben tartalmazó táptalajon a bélbaktériumok tenyé-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
