194283. lajstromszámú szabadalom • Kémiai eljárás L 17054 antibiotikum előállítására
1 ris mennyisége alapján számítva. A kiindulási anyag tisztaságától függően a találmány szerinti folyamat alapján nyert L 17054 antibiotikum lehet elég tiszta, de igényelhet további tisztítást is. A szokásos tisztítási módszerek, mint pl. kicsapás vízzel nem elegyedő oldószerekkel, pl. alkil-éterekkel, kicsapás a vizes oldat pH-állításával az izoelektromos pontra, extrakció oldószerekkel és kromatográfiás technikák alkalmazhatók. Egy előnyös tisztítási módszer magában foglalja a fordított fázisú oszlopkromatográfia alkalmazását. Ebben az esetben előnyös adszorbens a szilánazott szilikagél, amelynek részecske-eloszlása a 0,06-0,2 mm közötti tartományban van. Az eluálószer lehet azoknak a hidrofil keverékeknek egyike, amelyeket használni lehet ebben a tisztítási technikában. Ezeknek a hidrofil eluálószereknek jó példái a szerves savak ammónium-sói hígított vizes oldatainak keverékei, az acetonitril, vagy vízzel elegyedő kis szénatomszámú alkanolok. A szerves savak ammónium-sóinak hígított vizes oldataira jó példák a 0,1—6%-os vizes ammónium-formiát oldatok, míg a megfelelő' alkanolokra példák a metanol, etanol, propanol és hasonlók. Előnyös eluálószerek a vizes ammónium-formiát és az acetonitril keverékei 6 és 8 pH értékek között, vagy a vizes ammónium-formiát és a metanol keveréke. Különösen előnyös a nyers L 17054 antibiotikum tisztításához az az eljárás, amely az első fordított fázisú kromatográfiát foglal magában szilánozott szilikagélen (0,06-0,2 mm),lineáris lépcső grádienssel fejlesztve ki 5-21% acetonitril koncentrációval 0,2%-os vizes ammónium-formiátban, majd egy második oszlopkromatográfiát szilánozott szilikagélen (0,06—0,2 mm), amely eluálószerként acetonitril/víz 1:1 keveréket használ. A „lényegében tiszta” kifejezés a jelen közlemény szerinti antibiotikum vegyületekkel kapcsolatban olyan vegyületekre vonatkozik, amelyek HPLC szerinti titere nagyobb, mint 95% (a 254 mm-es UV-hullámhossznál meghatározott csúcs-terület százaléka alapján), maximális víz és oldószer-tartalmuk 10—15 tömegé között van és szervetlen maradék tartalmuk kisebb, mint 0,5 tömeg%. Az L17054 antibiotikum fizikokémiai jellemzői. a) fajlagos forgatóképesség: jaj20 = -34° (c = 1%, DMF) (DMF = dimetil-forrnamia)* b) kitűnően oldódik vízben pH > 8,0 értéknél, valamint dimetil-formamidban, dimetil-szulfoxidban, propilénglikolban és metilcelloszolvban, gyengén oldódik metanolban, csaknem oldhatatlan etiléterben és acetonban, c) ultraibolya abszorpciós spektruma, amely az 1. ábrábar látható, a következő abszorpciós maximumokat mutatja:- 0,1 n sósav-oldatban: max - 278 nm (E) %= ^0 6)- 0,1 n nátriunvhidroxid oldatban: max = 297 nm(Ei%= 118,8)- foszfát pufferben (pH 7,4) max = 277 nm (Ej 'c- 70,3) d) infravörös spektruma, amely a 2. ábrán látható, nujolban a következő abszorpciós maximumokat mutatja (cm-1-ben): 3700- 2000, 2970-2850/nujol, 1655, 1610, 1595, 1490, 1460/nujol/. 1375/nujol/, 1300, 1230, 1145, 1060,1020, 970, 890,850, 820, 2 720/nujol/, e) elemanalizise, gniután a mintát előzetesen inert atmoszférában 140°C hőmérsékleten szárítottuk (súlyveszteség = 7,8%), a következő hozzávetőleges százalékos összetételt jelzi (átlag): szén: 55,46%, hidrogén- 4,50%, nitrogén: 7,20%, klór: 4,67%, hamu:0,2%, f) Rf értékei az alább megadott TLC rendszerekben a következők: Futtató rendszer (térf./térf.) Rf érték I. Acetonitril/víz 75:25 0,32 (Merck 60 F^<4 szilikagélen) II. Acetonitril/5% vizes nátrium- 0,61 szulfát-oldat Megjelenítés: UV fény 254 nm hullámhosszon, 3%-os etanolos ninhidrin, 1%-os metanolos fluoreszcamin, g) retenciós ideje (t^) 8,3 perc, amikor HPLC-vel elemezzük, 150 x 4,0 mm-es Zorbax® ODS (5—6 m) oszlopot használva (Zorbax a Dupont Co. gyári védjegye egy oktadecil-szilán szilikagél mátrixra) és egy lineáris gradienssel eluálva 2 ml/perc áramlási sebes-, séggel, ahol a lineáris grádiens 40 perc alatt 0%-tól 50%-ig növekvő B oldat A oldatban (A oldat: 25 mmól/liter NaH2P04) (acetonitril 9:1, pH 6,0-ra pufferolva 0,1 n NaOH-val, B oldat: 25 mmól/liter NaH2 P04)acetonitril 3:7, pH 6,0-ra pufferolva 0,1 n NaOH -val), a HPLC meghatározás belső standardja a 3,5- dihidroxi-toluol (tR = 5,60 perc), h) a 3. ábrában látható 1H NMR spektruma 270 MHz -nél van rögzítve DMSO-d6-ban 60°C hőmérsékleten, 20 mg/ml minta koncentrációban (belső standard TMS (trimetil-szilán) = 0,00 ppm), a D20 kicserélési és szelektív csatolás-bontási kísérletek után nyert 1H NMR adatokból néhányat a következőkben adunk meg: ( ppm, szokszorozódás): 1,88, s, 2,85, d, 3,5, dd, 3-4, 4,20, d, 4,48, d, 4,50, d, 4,62, s, 496, ddd,5,18, d, 5,31, s, 5,35, d, 5,39, s, 5,68, d, 5,71, s, 6,20, d, 6,41, s, 6,51, s, 6,56, s, 6,74, d, 6,77, s, 6,80, s, 630, d, 6,98, d, 7,08, s, 7,15, d, 7,21, d, 7,28 d, 7,35, d, 7,50, d, 7,56, d, 7,64, d, 7,73, d, 7,86, s, 8,42, d, i) potenciometriás titrálási profilja három titrálási lejtést mutat 1/2 pH értékekkel 5,0-nál (1 egyenérték)' 7,0-nál (1 egyenérték) és 11,0-nál (5 egyenérték) metilcelloszolv/víz 4:1 keverékben, a vizsgált vegyület oldatát, amely 0,01 n HC1 fölöslegét tartalmazza metilcelloszolv/víz 4:1 keverékben, ugyanebben az oldószerkeverékben levő 0,01 n NaOH-val titrálva, l) egy savas funkciója képes sókat képezni, m) egy bázisos funkciója képes sókat képezni, és n) két cukor-maradéka van, amelyek az Of-D-mannóz és N-acetil-/3-I>glükózamin. A fizikokémiai adatok alapján, valamint más ismert glikopeptid-típusú antibiotikum vegyületek, mint pl. vankomicin és ristocetin szerkezetével összehasonlítva az L 17054 antibiotikumnak a (II) képletnek megfelelő szerkezet tulajdonítható, ahol a képleten belül R’jelentése (III) képletű csoport. Az ezután következő példa pontosabban illusztrálja a találmányt, de nem kívánja korlátozni a találmány körét. Példa L 17054 előállítása tedoplaninból U g lényegében tiszta teicoplanint adunk 100 ml 90%-os trifluor-ecetsavhoz és a keveréket kevertetjük mintegy 2 órán át szobahőmérsékleten. Ezután a ke-194.283 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
