194280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Új, nagy hatékonyságú gonaldoliberin-analógok és az ezeket tartalmazó gyógyaszati készítmények előállítására

1

2

194.280

5.

etil-acetát — piridln — ecetsav

víz “

480:20:6: 11

6.

etil-acetát - piridin - ecetsav

—

víz «

30:20:6:11

7.

, ecetsav — benzol •

1 + 15

8.

aceton — toluol »

1 :1

9.

etil-acetát - piridin - ecetsavvíz =

240 : 20 : 6 :11

10.

butanol — ecetsav — víz —

etil-acetát =

.,.1 :1 :1 :1

11.

butanol — ecetsav — víz (felső fázis) = 4:1:5

12.

butanol - piridin — ecetsav -víz*

120:20:6:11

13.

i-propanol - 1 mol/1 vizes ecetsavoldat =

2:1

14.

butanol - piridin — ecetsav —

víz =

45 : 20 : 6 :11

A leírásban használt aminosav és egyéb csoportrövidítések megegyeznek a peptid-kémiában használatos rövidítésekkel [J. Biol. Chem., 247, 977. (1972)]. A Glp rövidítés piroglutamil-csoportot, a Dbt pedig 3,5-dibrón> tirozil-csoportot jelöl.

1. példa

5

10

15

20

25

GIp—His—Trp—Ser—Tyr~Asp(OMe)-Leu—Arg—Proe til ami d-bisz ( tri flu or-ace tá t) a) Z-Asp(OMe)-Leu-Arg(N02)-Pro-etilamid 3,77 g (8,4 mmól) Z-Asp()Me)-OPFP 60 ml dimetil-formamiddal készített oldatát 0 °C-ra hűtjük, majd keverés közben 3,76 g (7,0 mmól) H—Leu—Arg (NOj)—Pro-etilamid hidrogén-bromid sót adunk a reakcióelegyhez. Két óra múlva lassan hozzácsepegtetünk még 1,16 ml (9,1 mmól) trietil-amint, és a keverést még egy éjszakán át folytatjuk 0 °C-on. Ezután a kivált sót kiszűrjük, a szűrletet bepároljuk, és a maradékként kapott olajat 240 ml etil-acetát és 80 ml mól/1 vizes kálium-hidrogén-szulfát-oldat keverékében oldjuk. A szerves fázist elválasztjuk és kétszer 70 ml mól/1 vizes kálium-hidrogén-szulfát-oldattal, majd háromszor 70 ml telített vizes nátrium-klorid-oldattal kirázzuk, vízmentes magnézium-szulfáttal szárítjuk, szűrjük és szárazra pároljuk. Az így kapott olajos anyagot 55 ml forró etil-acetát ban oldjuk, majd az oldatot 30 °C-ra hütjük és lassú ütemben 400 ml étert csepegtetünk hozzá. A kivált anyagról az étert dekantáljuk, majd a maradékot éterrel eldöizsöljük. Szárítás után 3,60 g (72%) cím szerinti terméket kapunk.

Móltömeg: 719.

Op.: 95-105 °C. [a]Mn *-66,8 0 (c = 1, metanol). RfJ =0,68; Rf9 = 0,23,T*f12 =0,67. b) H— Asp(OMe)— Leu— Arg— Pro-etilamid-diacetát 2,16 g (3,0 mmól) Z—Asp(OMe)—Leu—Arg(NOï) —Pro-etilamidot feloldunk 24 ml metanol és 24 ml ecetsav elegyében, majd keverés közben 900 mg 10%-os palládiunvcsontszén katalizátort adunk hozzá 24 ml vízben szuszpendálva, és ezután 8 órán át hidrogéngázt áramoltatunk át á reakcíóelegyen. Ezt követően a katalizátort kiszűrjük, a szűrletet bepároljuk, a maradékot éterrel eldörzsöljük, szárítjuk. így

30

35

40

45

50

55

60

1,73 g (87,3%) dm szerinti anyagot kapunk. Móltömeg: 660.

[a]2*Q = 57,0 ° (C = 0,5 metanol).

Rf*! =0,54^ =0,10;

Rf * 0,22; Rr1* =0,46.

c) Glp—His-Trp—Ser—Tyr—Asp(OMe)—Leu-Arg- Pro-etilamid-bisz(trifluor-acetát)

651 mg (0,908 mmól) Glp— His-Trp— Ser— Tyr— N2H3 pentapeptid-hidrazidot feloldunk 6 ml dimetilformamidban, az oldatot -15 °C-ra hűtjük, és keverés közben 0,61 ml 6 mól/1 dioxános hidrogén-klorid-oldatot (3,63 mmól) adunk hozzá..A reakcióelegy hőmérsékletét továbbra is -15 °C-on tartva, keverés közben 62,6 mg (0,907 mmól) nátrium-nitrit tömény vizes oldatát adjuk hozzá, majd a reakcióelegyet további 15 percen keresztül -15 és -20 °C közt keverjük. Ezután 545 mg (0,826 mmól) H-Asp(OMe)Leu-Arg-Pro-etilamid-diacetát só 6 ml dimetilformaniiddal készített és —15 °C-ra hűtött oldatát adjuk a fentiek szerint elkészített azid-oldathaz, majd rögtön ezután 0,50 ml (3,632 mmól) trietil-amint adunk hozzá. így a reakdóelegy pH-ja 8 körülire áll be. Ezt követően fél órán át —10 és—15 °C között, majd 0 °C-on keverjük a reakdóelegyet. Három óra múlva 60 pl 6 mól/1 dioxános hidrogén-klorid-oldattal (0,36 mmól) a reakcióelegy pH-ját mintegy 7-re állítjuk be, és tovább folytatjuk a keverést még 60 órán át ezen a hőmérsékleten. Ezután a kivált csapadékot kiszűrjük, a szűrletet bepároljuk és a bepárlási maradékként kapott olajos anyagot Sephadex G-25 töltetű (2,6 x 113 cm-es) oszlopon 10%-os, vizes ecetsav-oldattal tisztítjuk. Az elúciót az UV abszorpdós mérésével (287 nn>en), illetve vékonyrétegkromatográfiásan követjük. A kívánt anyagot tartalmazó frakciókat bepároljuk, a maradékot liofilizáljuk. így 904 mg nyers cím szerinti pepiidet kapunk. Ezt a fentiekben megadott módon tovább tisztítjuk Sephadex G—25 tölteten.

A cím szerinti pepiidet tartalmazó frakciókat egyesítjük, bepároljuk, majd a maradékot liofilizáljuk. 755 mg terméket kapunk, amit középnyomású folyadékkromatográfiával tovább tisztítunk. Fordított fázisú, 18 szénatomos alkil-csoportokat tartalmazó, Whatman LRP—1 jelű, 13—24 pm szemcseméretű töltetet és 2,5 x 40 cm méretű oszlopot használunk. Oldószerként i-propanol és 0,1%-os, vizes trifluorecetsav-oldat elegyét használjuk. A szerves komponens arányát 2%-ról 25%-ra növeljük a gradiens-elúdó folyamán. 400 -400 ml eluens-térfogatot használunk. A tiszta frakdókat egyesítjük, bepároljuk, majd liofilizáljuk. így 500 mg (41,6%) tiszta, cím szerinti pepiidet kapunk.

Móltömeg: 1454.

Rf = 0,60; Rf10 = 0,60; Rf4 = 0,06; Rf‘3 = 0,61.

2. p é 1 d a

Glp-His-Trp- Ser-Tyr-Asu-Leu-Arg- Pto-etílami d-dihidro-kiorid

25 mg (0,071 mmól) 1. példa szerint előállított

4