194049. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyulladásgátló készítmények előállítására
1 194.049 2 zés során testsúlyuk 15-20 grammal csökken, ezért a vizsgálati oldat kívánt térfogatát a következő napra vonatkoztatva állapítottuk meg. Ivóvíz tetszés szerint áll rendelkezésükre az éjszaka folyamán és a kísérlet ideje alatt is. A kísérleti napon testsúlykilogrammonként 4,0 ml vizsgálati oldatot adunk be mind orális, mind parenterális adagolási módnál. Ismerve a körülbelüli testsúlyt (ezáltal a beadandó oldat térfogatát) és a gyógyszer alkalmazandó dózisát (mg/kg), a fekélyellenes hatóanyag és az indometacin szükséges mennyiségét előző napon kémcsövekbe kimérjük. A vizsgálandó fekélyellenes hatóanyagot dihidrokloridsó alakjában oldjuk vagy szuszpendáljuk. Általában desztillált vizet használunk vivőanyagként. Az indometacint sóoldatban szuszpendáljuk, és egy kis csepp Tween 80-nal (poliszorlát 80) homogenizáljuk, hogy megakadályozzuk a részecskék összetapadását. Az indometacin nem marad szuszpendálva a sóoldatban, ezért fontos, hogy mielőtt felszívunk a fecskendőbe, a kémcső alapos vortexolásával újraszuszpendáljuk az anyagot. Az állatok véletlenszerű kiválasztásával (rendszerint a kísérleti állatok 20%-ának lemérésével) megállapítjuk a csoport átlagos testsúlyát. Minthogy valamennyi dózist a testsúly-kilogrammonként 4 ml térfogatban visszük be, az átlagos testsúly-kilogrammot osztva 250 mg-mal, megkapjuk az egyes állatra vonatkozó térfogatot. Az állatokat kivesszük a közős ketrecből, beadjuk szájon keresztül a vizsgálati anyagot vagy a vivőanyagot, és egyedi ketrecekbe helyezzük. A fekélyellenes hatóanyag beadási ideje az indometacinos kezeléshez viszonyítva változik az éppen alkalmazott vizsgálati protokolltól függően. Egy 7 csoportos kísérletnél, ahol csoportonként 7 állat van, a hatóanyag adagolási ideje előnyösen 45 perc. Ez lehetővé teszi, hogy az egyes állatnál az orális beadásra körülbelül egy perc jusson. Az indometacin intraperitoneális beadását a gyógyszer adagolásának befejeztével kezdjük, vagyis az említett esetben ekkor visszamegyünk az első állathoz, és megkezdjük az indometacin befecskendezését. Az indometacinos kezelésnél is körülbelül percenként kerül sorra a következő állat. Ha a vizsgálati anyag várhatóan nem hosszú hatóidejű, kívánatos, hogy a vizsgálat ideje alatt egy második adagolást is végezzünk. Az indometacinos kezelés és az állatok leölése között általában hat és fél óra telik el, ehhez hozzáadva a 45 perces időtartamot, ami a hatóanyag beadásától elmúlt, a vizsgálat teljes ideje hét és egynegyed órának adódik. Ha a gyógyszer másodszori adagolása is szükséges, ezt a félidőnél, tehát körülbelül az első adagolást követően három és fél órával végezzük. A kontroll állatok természetesen ugyanebben az időben kapják a vivőanyagot. A patkányokat hat és fél órával az indometacin beadását követően öljük le. Eltávolítjuk a gyomraikat, a nagygörbület mentén felnyitjuk és folyó vízzel kimossuk. A vízáram alatt tartva enyhén dörzsöljük a nyálkahártyát, hogy ezzel eltávolítsuk a nyálka egy részét és a nagy vérrögöket, de kerüljük az erőteljes dörzsölést, mert ezzel vért sajtolhatunk ki az indometacin kiváltotta vérző eróziós helyekből, és nehéz lesz meglátni az erodeált helyeket. A gyomrot egy lapos tálcában, a nyálkahártyával felfelé, sóoldattal megnedvesített papírtörülközőkre fektetjük. Megszámoljuk a kisebesedett helyeket, vagy egy éjszakán át állni hagyjuk a gyomrot, é< másnap vizsgáljuk. Ha egy éjszakán keresztül tartjuk a gyomrot, először sóoldattal nedvesítjük, és polietilén zacskókba rakva, hűtőszekrénybe helyezzük. Az indometacin által kiváltott sebesedés rendszerint sötétbarna vagy fekete színű erózióként jelenik meg a gyomor korpuszán (a savelválasztó részen). A sötét elszíneződést az okozza, hogy az erodeált részeken a gyomorsav reagál a vérrel. A sebesedés pontszerű vagy lineáris. A sebesedés nagyságának mennyiségi kiértékelése arra vall, hogy a seb átlagos hossza 1 mm. A méretétől függetlenül, minden egyedi sebesedést egynek veszünk. Ha az állatok valamelyik csoportjánál a seb formája eltér a kontroliétól, ezt feljegyezzük. Néhány sebnek nincs meg az elkülönítő sötét elszíneződése, de alapos vizsgálattal mégis felismerhető az erózió helye. Egy csoporton belül a sebek száma általában nem nagyon változik. Ha azonban egy csoport valamelyik eredménye gyanúsan magas vagy alacsony, a szélső értéket nem vesszük figyelembe. Lineáris regressziós analizissel számoljuk ki (a legkisebb négyzetek módszere) az IDJ0 értéket, azaz azt a dózist (mg szabad bázis/kg testsúly), ami ahhoz szükséges, hogy az indometacin indukálta sebesedések száma a kontrolihoz képest 50%-kal csökkenjen. Az I. táblázatban egy ilyen vizsgálat tipikus eredményeit foglaltuk össze. I. táblázat IDso P °' (m8/k8) adagolás vegyidet A B C D egyszeri dózis 1,4 - — 7,5 két dózis 1,5 10,5 4,4 2,0 Az A vegyület: 2-guanidino-4-(2-metii-4-imidazolil)-tiazol-dihidroklorid. Minthogy a vegyület vizsgált legkisebb dózisa — 2,2 mg/kg - a sebesedések számát több, mint 50%-kal (63%) csökkentette, az IDS értéket erre a vegyületre extrapolációval állapítottuk meg, feltételezve, hogy a 0,075 mg/kg dózisnak nincs hatása. A B vegyület: 2-guanidino-4-(2-hexil-amino-4-imidazolil)-tiazolil)-tiazol-dihidroklorid. A C vegyület: 2-(N-benzil-guanidino)-4-(2-metil•4 -imidazolil)-tiazol -dihidroklorid. A D vegyület: 2-guanidino-4-(4-imidazolil)-tiazol-dihidroklorid, amit monohidrobromidból készítettünk az 5. és 6. példában ismertetett eljárással. 2. példa A példában azt az eljárást ismertetjük, mellyel a 2-guanidino-4-(2-metil-4?imidazolil)-tiazolnak a piroxikám által kiváltott gyomorfekély-képződéssel szembeni védőhatását kívánjuk szemléltetni patkányon. Mi a vizsgálatokhoz 140-160 g súlyú, "specifikusan kórokozóktól mentes" felnőtt hím CD törzsű (Sprague-Dawley) patkányokat használtunk, amiket a Charles River Breeding LaboratoriestŐl (Kingston, N.Y., USA) szereztünk be. Az állatokat egy héten át szoktatjuk a környezetükhöz, mely idő alatt a testsúlyúk eléri a 200-225 g-ot. Az állatokat 16 órán keresztül éheztetjük, és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
