193911. lajstromszámú szabadalom • Eljárás magas biológiai aktivitású antimicin-a komplex előállítására
193911 nyésztésére szolgáló táptalajban a gomba által asszimilálható szén- és nitrogénforrá!SOk, szervetlen sók~es egyéb járulékos alkotórészek, mint pl. habzásgátlók vannak jelen. Az antimicin erjesztéses oldatból törté- 5 nő elkülönítésére különféle extrakciós módszerek alkalmazhatók. Mivel az antimicin-A komplex vízben gyakorlatilag oldhatatlan, ezért a fermentlé szűrésekor a micéliumhoz kötve található, és 10 onnan különböző szerves oldószerekkel, mint alkoholokkal, ketonokkal, klórozott szénhidrogénekkel vagy ezek elegyeivel leoldható. Különféle tisztítási lépések, mint pl. átcsapás vagy kromatográfia után az antimicin-A 15 komplex szerves oldószerekből kristályosítható. A fentiek alapján a találmány tárgya: eljárás antimicin-A komplex előállítására fermentációs úton. Az eljárás abban áll, hogy 20 a Streptoverticillium hiroshimense sugárgomba faj MNG 00286 számon letétbe helyezett törzsét, vagy valamely antimicin-A komplexet termelő mutánsát vagy variánsát, fehérjét, szénhidrátot valamint ásványi sókat tar- 25 talmazó táptalajon, aerob körülmények között, 20-40 °C-on, legalább 50 órán át tenyésztjük, és az így kapott tenyészetből az antimicin-Á komplexet kívánt esetben, ismert módon elkülönítjük. 30 A találmány szerinti eljárás egy előnyös kiviteli módja szerint úgy járunk el, hogy a Streptoverticillium hiroshimense sugárgomba törzset szójalisztet, kazein hidrolizátumot, glükózt és kálciumkarbonátot tártál- 35 mazó táptalajon, 28 °C-on, keverés és levegő állandó átfuvatása mellett 70-100 óráig tenyésztjük, majd az így kapott micéliumtömegről az antimicin komponenseket szerves oldószerekkel, célszerűen diklórmetán-meta- 40 nol eleggyel leoldjuk és a bepárlás után kapott nyers antimicin komplexet kromatográfiás úton, célszerűen szilikagélen — diklórmetán-metanol eleggyel végzett gradiens eluciós kromatográfiával megtisztítjuk, és a ka- 45 pott antimicin komplexet szerves oldószerekből célszerűen benzol-hexán elegyből átkristályosítjuk. A találmány szerinti eljárás bemutatására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 50 1. példa a.) Antimicin-A komplex előállítása aerob fermentációval A Streptoverticillium hiroshimense sugár- 55 gomba faj MNG 00286 számon letétbe helyezett törzsét módosított Gauze I. agaron tenyésztjük, melynek az összetétele a következő: 3 kálium-nitrát 1 g dikálium-foszfát 0,5 g magnézium-szüli át-heptahidrát 0,5 g nátrium-klorid 0,5 g vas/II/-szulfát-heptahidrát 0,01 g vízoldható keményítő 20 g +Difco casamin 5 g Bacto agar 15 g desztillált víz ad 1000 ml pH sterilezés előtt 7,0. Megjegyzés: +Difco casamin: savval hidrolizált kazein. A keletkező spórákat 5 ml víz segítségével lemossuk, és a kapott spóraszuszpenzió 1 ml-ével 100 ml táptalajt oltunk, melynek összetétele a következő: szója liszt kazein hidrolizátum 40 g 3 g (száraz anyag) 20 g 1,5 g 20 ml 1000 ml glükóz kalcium-karbonát pálmaolaj csapvíz ad pH sterilezés előtt 7,0. A tenyészetet 48 óráig, 20 °C-on rázatjuk síkrózógépen. 100 liter hasznos térfogatú inokulumkészülékben az alábbi összetételű táptalajt készítünk: szójaliszt kazein hidrolizátum 40 g 3 g (száraz anyag) 20 g 1,5 g 1000 ml glükóz kalcium-karbonát csapvíz ad pH sterilezés előtt 7,0. Sterilezés után a fent leírt oltóanyaggal beoltjuk az inokulumkészülék tartalmát, és percenként 100 liter levegő átbuborékoltatása és 500-as fordulatszámú keverés közben, 28 °C-on sterilen növesztjük az organizmust. 45-50 óra múlva, amikor már a tenyészet megfelelően kinőtt, az inokulumot átoltjuk egy 1000 liter hasznos térfogatú fermentorba, amely szintén a fenti összetételű táptalajt tartalmazza. Habzásgátlóként szükség szerint 3A habzásgátlót (gyártó: Chinoin, Budapest) alkalmazunk. A fermentációt 28 °C-on 1000 liter levegő percenkénti átáramoltatása és percenként 500-as fordulatszámú keverés mellett 70-100 órán keresztül folytatjuk, amikor is a fermentlé 500.-900pg/ml aktivitást mutat. A fermentlé aktivitását agardiffúziós módszerrel, Saccharomyces cerevisiae tesztorganizmussal határoztuk meg. b.) A nyers antimicin-A komplex izolálása Az a.) pont szerint előállított 920 liter fermentléhez (750 pg/ml) 5 kg Hyílo-supercelt adunk, majd állandó keverés közben az elegy pH-ját 25 %-os kénsavval 3,5-re állítjuk be. 10 perces keverés után a fermentlevet leszűrjük, és a micéliumot 50 liter vízzel átmossuk. A szárazra leszivatott micéliumot (súlya 135 kg) erőteljes keverés közben 300 1 diklórmetán : metanol 2 : 1 arányú keverékével extraháljuk. Egy órás keverés után az elegyet megszűrjük és az alsó diklór-3
