193905. lajstromszámú szabadalom • Glikopeptid antibiotikumok előállítása biokonverzió útján
193905 Vegetatív tenyészeteket ferde agar tenyészettel, a tenyészet liofilizált pelletjeivel (egy liofilizátum per 50 ml tápközeg, 250 ml-es lombikban) és folyékony nitrogénben tartott kultu rákkal (0,8% inokulum) indítunk. Inkubált vegetatív táptalajt (5 térfogat%) használunk 50 ml szaporító táptalaj beoltására, melynek összetétele: Alkotórészek Mennyiség (t%) Glükóz 2,5 Kukoricakeményítő 3,5 Melasz 1,5 Glicerin 1,5 Élesztő 2,0 K2HP04 0,05 (NH4)2S04 0,025 CaC03 0,2 Csapvíz 100%-ig Sterilezés előtti pH=6,5; beállítás 6,8-ra; sterilezés után a PH=6,5. A beoltott szaporító táptalajt 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban 30°C-on 72 óráig inkubáljuk 5 cm kilengést és percenként 250 fordulatot végző forgó rázógépen. B. A. biokonverzió Aktaplanin A-faktort (100 mg) szűrés útján sterilezett vízben oldunk és hozzáadjuk (0,3 mg per ml végkoncentrációban) az átalakító A.missouriensis CSV 558 (NRRL 15646) A. pontszerinti tenyészet 5 napos, 1 liter térfogatú fermentációjához. A fermentációt további 48 óráig inkubáljuk. C. CUC/CSV izolálása A fenti B. rész szerint biokonverziót hajtunk végre. A fermentlevet leszűrjük és a micéliumot vízzel extraháljuk pH 10,5-nél. E kivonatot (550 ml) 100 ml HP-20 gyantával töltött oszlopon tisztítjuk, vízzel mossuk, majd CH30H/H20-CH30H gradienssel eluáljuk. A frakciókat egyesítve liofilizált nyersterméket (190 mg) állítunk elő. E termék egy részét (100 mg) 5 ml CH3CN/pirOAc (36:64; pH 3,6) elegyben oldjuk és Lichroprep RP-8 gyantával (25-40 pm) töltött 300 ml-es üvegoszlopra visszük fel. Az oszlopot CH3CN/0,5% piridil-acetát (1:4; pH 3,6) eleggyel eluáljuk 8 ml/min átfolyási sebességgel. A terméket 280 nm-nél UV abszorbancia alapján, B. subtilis biológiai próbával és analitikai HPLC-vel detektáljuk. A kívánt aktivitást tartalmazó frakciókat egyesítjük, In NaOH-oldattal pH 6,5-re állítjuk be és bepároljuk az acetonitril eltávolítása céljából. A képződött vizes oldatot (50 ml) 12 ml LP1-C18 gyantával (lásd 4,293,482 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás, 7. példa) töltött 4 ml-es oszlopra visszük fel. Az oszlopot vízzel (100 ml) mossuk a só eltávolítása céljából, és az aktív anyagot CH3CN/H20 (7:3) eleggyel eluáljuk. Az eluátumot bepárolva és liofilizálva 10 mg tisztított CUC/CSV antibiotikumot kapunk. 7 D. CUC/CSV antibiotikum aktivitásának vizsgálata A teljes fermentlevet (pH 10,5-re beállítva) lecentrifugáljuk. A felüluszó pH-ját 7,0-re állítjuk be. Az így előkészített mintákat Bacillus subtilis lemezpróbával és.vékonyrétegkromatográfiával (TLC) vizsgáljuk szilikagél-lemezeket (Merck, előrebevont plasztik Lapok; szilikagél 60, fluoreszcens indikátor nélkül) és aceton (víz)ammónia (160:40:1) oldószerrend' szert használva. A detektálást biokromatográfiával hajtjuk végre kevés táptalajban B. subtilist használva és a lemezeket 37°C-on körülbelül 18 óráig inkubálva. A CUC/CSV antibiotikum jellemzői a következők: (Elemi analízis (%) Számított“ Talált 8 C-90 49,46 49,28 H-98 5,65 3,35 N-7 4,49 4,55 0-41 38,80 39,82 (különbségből) Cl-1 “C 1,62 9oH98N7041Cl.l 2H20-ra 2,00 Ultraibolya abszorpció (metanolban): Xmox 278 nm, sav (e~ 17000). Xmax 277 nm, 361 nm, semleges (e" 18500, 9000) kmax 295 nm, 340 nm, bázis (e-21000, 14500) 1200-as molekulatömeg alapján számítva. A vegyület 230 nm-nél mutat végabszorpciót. Oldhatóság: oldódik dimetil-szulfoxidban, dimetil-formamidban, acetonitril/víz elegyben és alkohol/víz elegyekben. Tömegspektrometria: (gyors atombombázás): FÁB MS alapján a molekulasúly 1968. 2. példa CUC/CSV előállítása aktaplanin A-faktornak CUC 014 tenyészettel való biokonverziója útján Az 1. példa eljárását követve, de CSV 558 tenyészet helyett CUC 014 (NRRL 15647) tenyészetet használva az aktaplanin A-faktort CUC-CSV antibiotikummá alakítjuk át. 3. példa A CUC/CSV antibiotikumhoz használt analitikai HPLC rendszer Oszlop: 4,6 x 250 mm rozsdamentes acél Töltet: Shandon ODS Hypersil-5 mikron Oldószer: CH3CN/0,5M KH2P04, H3P04-gyel pH 3,2-re beállítva (21:79) Átfolyási sebesség: 1,0 ml/min De tektális: UV fényben 220 nm-nél Papírsebesség: 20 cm/h Retenciós idő: 9,3 min. 4. példa . A 4696 B2 konverziós termék előállítása (le vegyület) Az 1. példa eljárását alkalmazva, aktaplani r (A 4696) B2-faktort (200 mg) adunk az A. 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
