193887. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enkefalináz-gátló szubsztituált alanin-származékok és e vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
193887 centrációja 40 nmól legyen. Az enzimet és szubsztrátot magába foglaló reakcióelegy össztérfogata 250 pl. Az inkubálást 90 percig 37°C-on végeztük. A reakciót úgy állítottuk le, hogy a csöveket 15 percre forró vízfürdőbe helyeztük. Az assay termékeket egymástól vékonyrétegkromatográfiás úton választottuk el. A reakcióelegy egy 4 pl-es mintáját egy 20x x20 cm-es Baker-ilex Silica Gel IB lemezre csepegtettük nem jelzett standardokkal együtt (Met -ENK, tirozin, tirozil-glicin, tirozil-glicil-glicin) és a komponenseket izopropanol : etil-acetát : 5%-os ecetsav = 2 : 2 : 1 oldószerelegyben együtt kromatografáltuk, mely elegy képes a Met5-ENK komponenst a lebomlási termékeitől elkülöníteni. A teljes futtatási idő kb. 17 óra. A futtatást követőén az előhívás ninhidrin-permettel történt. Ezeket a foltokat a folt felett lévő lemezrészszel együtt a lemezből kivágtuk és a megfelelő radioaktivitást folyadék -szcínt il 1 ációs számlálással határoztuk meg. Az 1C50 értékeket lineáris regressziós technikával állapítottuk meg. Ezt az eljárást alkalmazva az egyes vegyületekre, a következő nanomoláris koncentrációkat kaptuk, amelyeknél az enkefalináz A működését 50%-ban gátolják: A) Táblázat Vegyület Enkefalináz A gátlás IC50 (nmól) 17 A N.A.1 B N.A.1 C N.A.1 D N.A.1 E 230 F 580 G 6,4 H N.A.1 J 2,5 K 0,9 L N.A.1 1 105 nmól-nál alacsonyabb koncentrációban nincs aktivitás. A következő vizsgálatokat alkalmaztuk annak megállapítására, hogy a nevezett vegyületek a (DAla2-Mer) - enkefalinamid (DAEAM) analgetikus hatását hogyan potencirozzák. Ezen eljárás alkalmazásának hátterét Chipkin,, R.E., lorio.L.C.,Barnett,A.,Berger J. és Billard, W. adja meg a „Regulatory Peptides: From Molecular Biology to Function" című műben) szerk. E.Costa és M. Trabucchi, Raven Press, New York, 1982, 235— 242 old.). A kísérlethez a Charles river Breeding Labs-től (Mass.) származó him, 19—23 g súlyú CFl egereket alkalmaztunk, dózisonként vagy dózis kombinációként 10-et. A farokrándulási vizsgálatot Dewey és Harris szerint végeztük (Methods in Narcotic Re- 10 search, Eds., S. Ehrenpreis and A. Neidle, 101 —109. oldal, Marcel Dekker, Inc. New York, 1975) sugárzó hővel való ingerlést alkalmazva. A kontroll látensidők (tipikusan 2—3 másodperc) meghatározása után az egerekbe először (se vagy po) hordozót vagy egy vegyületet, injektáltunk, majd egy megfelelő idő eltelte után intracerebroventrikulárisan hordozót (10 pl sóoldat) vagy DAEAM-ot injektáltunk Efaley és McCormic szerint [(Br., J. Pharmacol., 12, 12 (1957)]. A farokrándulási látensidőket 30 perccel később ismét meghatároztuk, mivel korábban ez az idő mutatkozott a DAEAM esetében az analgezia csúcsidejének, 10 másodperces rövidítéseket alkalmaztunk. A fenti eljárás szerint a következő ED50 értékeket (az a dózis, amelynél az állatok fele analgeziát mutat) kaptuk a kiválasztott vegyü letekre. 18 B) Táblázat Vegyület DAEAM poten ED50 (beadási A 155 mg/kg (po) B 37 mg/kg (po) C 100 mg/kg (po) D 100 mg/kg (po) E 30—60 mg/kg (po) F 100 mg/kg (sc) G 50 pg (icv) H 100 mg/kg (po) 50 pg (icv)* 1 2 * * K L 2ED 100 100 mg/kg (po) Meg kell jegyeznünk, hogy az A, B, C, F és H vegyületek észter-származékok; a H a G vegyület észter-származéka és L egy amid-származék. Ügy találtuk, hogy az ilyen származékká alakítás lehetővé teszi, hogy az egyébként a gyomor-bél-traktusból rosszul abszorbeálódó eredeti vegyület hatását orális adagolás esetén is kifejtse. Ezek a származékok, amelyek in vitro 105 nM koncentrációban nem mutatnak hatást (ld. A) Táblázat), in vívó bioaktiválódnak és az eredeti in vivo enkefatináz A inhibitorokat a központi idegrendszeren belül olyan helyre szállítják, ahol a hatást kifejthetik (Id. B) Táblázat). SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás az (I) általános képletü alaninszármazékok, valamint gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására — a képletben a csillagok aszimmetrikus szénatomokat jelölnek; R, fenil-(kevés szénatomos)-alkil- vagy difenil- (kevés szénatomos) -alkilcsoportot; R2 hidroxilcsoportot, -OCH2OCO-(kevés szénatomos)-alkilcsoportot vagy (a) általá-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
