193870. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a digitális lanata primer glikozidjainak szekunder glikozidokká történő átalakítására
193870 1 ml 10 tf/tf% metanolt tartalmazó vizes oldatba, amelynek pH-értékét 20 mM citrát pufferrel 5-re állítottuk be 5 mg lanatozid-C-t szuszpendálunk, majd 100 pl az 1. példa b.) pontja szerint készített Helix pomatià fetülúszót (kivonatot) adunk hozzá. A rendszert intenzív keverés mellett 33°C hőmérsékleten tároljuk. Az átalakulást vékonyréteg videodenzitometriás módszerrel követjük nyomon. 20 óra után az átalakulás (digoxin képződés) közel kvantitatív (>98%). 5. példa Lanatozid-C enzimkatalitikus átalakítása 200 pl Helix pomatia fe'Iülúszóhoz (1. példa b. pont) 700 pl mM citrát pufiért adunk, ily módon a kivonat pH-értéke = 5. 20 mg lanatozid-C-t 1 ml metanolban oldunk, és az oldatból 100 pl-t a Helix pomatia kivonathoz adunk erőteljes keverés mellett 33°C hőmérsékleten. 1 óra alatt az átalakulás 98%. 6. példa Mindenben a 5. példa szerint járunk el, azzal a változtatással, hogy a lanatozid-C metanolos oldata helyett 2 mg lanatozid-C-t 10 tf/tf% metanolt tartalmazó vizes oldatba szuszpendálunk. Az átalakulás sebessége lassúbb, de a mértéke azonos. 7. példa A 6. példa szerint járunk el, azzal a változtatással, hogy 200 pl Helix pomatia felülúszó helyett 100 pl-t alkalmazunk. Az átalakulás (digoxin képződés) sebessége lassúbb, de a mértéke azonos. 8. példa Digitalis lanata levélben jelenlévő primer glikozidok szekunder glikoziddá történő enzimkatalitikus átalakítása Szárított Digitalis lanata levelek őrleményét háromszoros mennyiségű, pH = 5 értékű citrát-puffer oldatban ETA-012 típusú mixerben 5 percig n = 10.000 fordulatszámmal megőröljük, ezután 1/10 térfogatnyi, az 1. példa b.) pontja szerint készített, felülúszó enzimkatalizátort adunk hozzá, ezt követően a rendszert egy órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk, majd az 1. példa a.) pontjában ismertetett módszerrel a szekunder glikozidokat meghatározzuk. Az enzimkatalitikus átalakítás előtti, majd az utáni oldatok vizsgálati eredményeit összevetve megállapítható, hogy a primer glikozidok 100%-ban szekunder glikozidokká alakultak át. Szárított Digitális lanata levelek helyett kiindulhatunk, frissen szedett, szikkasztott fóliumból is, az enzimkatalítikus átalakítás révén minden esetben teljes a szekunderesedés A szekunder glikozidok arányát a kiindulási levélben jelenlévő primer glikozidok szabják meg. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás a Digitális lanata primer glikozidj (á/ai) nak szekunder glikozid (d/okk) á 7 történő átalakítására Helix pomatia (éticsiga) enzimjeinek alkalmazása utján, azzal jellemezve, hogy a. ) a friss vagy mélyhűtött Helix pomatia teljes testéből közvetlenül vízzel szuszpenziót (homogenizátumot), kívánt esetben a szilárd részek eltávolításával kivonatot (felülúszót) —, b. ) a Digitális lanata b, primer glikozidj(á/ai)ból b,, rövid szénláncú alkanolban telített, de legalább 0,5 mg/ml koncentrációjú oldatot vagy b|2 mintegy 1-20 mg/ml koncentrációjú szuszpenziót, vagy b2 növényből, előnyösen leveléből vízzel szuszpenziót készítünk, c. ) 10-50 tömegegységnyi Helix pomatia testéből az a., lépés szerint készített szuszpenzióhoz (homogenizátumhoz), kívánt esetben kivonatához (felüldszó) 1 tömegegységnyi Digitális lanata primer glikozidj(á/ai)nak a b., lépés szerint készített oldatát vagy szuszpenzióját vagy 1 tömegegységnyi primer glikozido(ka)t tartalmazó Digitális lanata szuszpenzióját adjuk, adott esetben az adagolás sorrendjét felcseréljük, majd d. ) a reakcióelegyet 25-45°C, előnyösen 33- -39°C hőmérsékleten 0,3-20 órán át 4-7 közötti pH-értéken inkubáljuk, az ily módon kapott Digitális lanata szekunder glikozidj (á/ai) t ismert módon kinyerjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Helix pomatia testéből 5- -50%, előnyösen 15-40 tömeg% tartalmú szuszpenziót (homogenizátumot) készítünk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szuszpenzió szilárd részét eltávolítjuk és a kivonatot (felülúszót) alkalmazzuk. 4. Az 1. igénypont bn pontja szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a primer glikozido(ka)t metanolban oldjuk fel, vagy szuszpendáljuk. 5. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az átalakítást (inkubálást) legfeljebb 15 tf% rövid szénláncú alkanolt, előnyösen metanolt tartalmazó közegben végezzük. 6. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az átalakítást (inkubálást) 33-37°C hőmérsékleten és 5-6 pH-értéken végezzük. 7. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a primer glikozid oldat vagy Digitális növény, előnyösen levél szuszpenzió alkalmazása esetén az átalakítást (inkubálást) 30-60 percig végezzük. 8. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás módja, azzal jellemezve, hogy primer glikozid szuszpenzió alkalmazása esetén az átalakítást (inkubálást) legfeljebb 1 napig végezzük. 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
