193696. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az új SB 22484 antibiotikum-komplex előállítására
193696 16 összetételű táptalajt tartalmaz. Ezt a fermentort 28°C hőmérsékleten inkubáljuk, 240 ford/ /perc mellett, 1 térf./térf./perc levegőztetési sebességgel. A maximális antibiotikus aktivitást kb. 40 órás fermentáció után érjük el. Az antibiotikum-szintet a papírkorongos agarlemezes vizsgálati módszerrel határozzuk meg, kísérleti organizmusként Neisseria caviae ATCC 14659 törzset használva, amelyet előzetesen egy éjjelen át 37°C-on agy-szív-agar táptalajon tenyésztettünk. A tenyészet 10 cm-es papírlemezes 23 mm-es gátlási zónát eredményez. 3. példa. Az SB 22484 antibiotikum elkülönítése és tisztítása A 60 milliliter térfogatú fermentlevet ClarcelR flow-ma szűrési segédanyag jelenlétében szűrjük, a sztírlet pH-ját kb. 7,0-ra állítjuk be és etil-acetáttal (kb. 60 ml) extraháljuk. A szerves fázist centrifugálással elkülönítjük és kis térfogatra töményítjük be. Az olajos maradékhoz petrol-étert adunk és szűréssel összegyűjtjük a kicsapódott nyers antibiotikumot. Ennek az anyagnak egy hányadát (4,5 g) 50 ml metanolban oldjuk, felviszszük egy 1 m-es kromatográfiás oszlopra — amely metanolban szuszpendálva 1,5 ml Sephadex L 20-at tartalmaz — és a rendszert ugyanezzel az oldószerrel extraháljuk. Kb. 20 ml-es frakciókat szedünk és ezek aktivitását papírkorongos diffúziós vizsgálattal — N. caviae ATCC 14659 alkalmazásával —, valamint TLC és HPLC elemzéssel határozzuk meg. Az antibiotikumot tartalmazó frakciókat összeöntjük és szárazra pároljuk. Az olajos maradékot minimális mennyiségű tetrahidrofuránban oldjuk, az oldathoz etil-étert adunk és az elegyet addig rázzuk, amíg csapadék képződik. Ezt összegyűjtjük és szárítjuk. Kb. 960 mg tiszta SB 22484 antibiotikum készítményt kapunk, amely az előzőekben megadott fiziokémiai tulajdonságokkal rendelkezik. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás az új SB 22484 antibiotikum komplex — melynek fontosabb komponensei az SB 22484 antibiotikum 1., 2., 3. és 4. faktor — előállítására, amely antibiotikum a következő tulajdonságokkal rendelkezik: 15 A) UV abszorpciós spektrum, a következő adszorpciós maximumokkal: pfVo C-l cm lambda,TM* (nm) a) 0,lNHCl-ban 230 663 283 192 332 343 b) pH 7,38 foszfát-pufferben 230 719 323 391 c) 0,1N nátrium-hidroxidban 323 387 d) metanolban 229 715 320 365 B) IR adszorpciós spektrum, a következő adszorpciós maximumokat mutatja (cm“1): 3700-3080, 2980-2840 (nujol); 1645; 1560; 1455 (nujol); 1375 (nujol); 1305; 1240; 1215;1145;1090; 1060;1035;990;945; 910; 890; 850; 810; 720 (nujol), C) NMR spektrum a következő jelcsoportokat (ppm-ben) mutatja a 270 MHz H-NMR üzemmódban hexadeuteroacetonban felvéve, belső standardként TMS-t (0,00 ppm) használva, ppm-ben: 0. 77.(3H), 0,83 (3H), 1,21-1,24 (3H), 1,2- -2,7 (5H), 1,67 (s, 3H), 1,73 (3H), 2,01 (s, 3H), 3,20 (s, 3H), 3,3-5,6 (11H), 5,4-6,7 ( 13H), 6,04 (1H), 7,40 (1H), 7,68 (1H), 10,53 (1H), D) tömegspektrum, amelyet közvetlen folyadék-beveztéses LC-MS módszerrel veszünk fel, HP 5985 B készülék alkalmazásával, a negatív ionos üzemmódban dolgozva és az LC-t a következő körülmények között végezve: oszlop: Brownlee Lab. Rp 8 10 pm, 25 cm (oktilszilánnal funkcionalizált szilikagél), áramlási sebesség: 1 ml/perc, eluálószer: acetonitril: 0,1 M ammónium-formiát 60:40 arányú elegye, négy fő csúcsot mutat, amelyek retenciós ideje 4,48, 5,03, 5,65 ill. 7,25 perc, mimellett az ezeknek megfelelő komponenseket SB 22484 antibiotikum 1., 2., 3. és 4. faktornak nevezzük, E) a következő fő fragmentációs csúcsok az előbbiekben megnevezett antibiotikum faktorok, nevezetesen az SB 22484 antibiotikum 1,2., 3. és 4. faktor vonatkozásában: 1. faktor: 752, 734, 716, 684, 538, 598, 566, 500 2. faktor: 766, 748, 730, 698, 652, 612, 580 3. faktor: 752, 734, 716, 684, 638, 598, 566, 500 4. faktor: 766, 748, 730, 698, 652, 612, 580, 500, F) a következő R/ értékek különböző kromatográfiás rendszerekben, szilanizált szilikagél 60 F254 Merck lemezeket alkalmazva: eluciós rendszer /térf./térf,/térf./ R; érték 1) NaH2P04/metanol 4/6 arányú elegye 0,44 0,50 0,55 2) NaH2P04(metanol)acetonitriI 4/5/1 arányú elegye 0,52 0,57 0,63 3) 0,05M tetrabutil-ammónium-foszfát (pH 7,0): metanol 4/6 arányú elegye 0,46 0,50 0,55 kimutatás UV fénnyel (254 nm-en), 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
