193538. lajstromszámú szabadalom • Eljárás teichomycin A2 tiszta 1,2,3,4 és 5 faktorok elkülönítésére
1 193538 A találmány tárgya: eljárás a teichomycin Aj egyes antibiotikus komponensei, nevezetesen az 1,2,3,4 és 5 faktor lényegében tiszta alakban való előállítására. A teichomycin A2 egyike azoknak a különböző antibiotikus anyagoknak, amelyeket oly módon állíthatunk elő, hogy az Actinoplanes Teichomyceticus ATCC 31121 törzset asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat, valamint szervetlen sókat tartalmazó táptalajban tenyésztjük (1. a 839.259 sz. belga szabadalmi leírást). Az említett szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint egy teichomycin A,, Aj és A3 antibiotikumot tartalmazó keveréket nyerünk ki az elkülönített fermentléből oly módon, hogy azt egy megfelelő, vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel extraháljuk és az extraháló oldószerből a keveréket ismert módon kicsapjuk. Az így kapott antibiotikum keverékből a teichomycin A2-t Sephadex-szel végzett oszlopkromatográfia segítségével különítjük el. A teichomycin A2-t, miután szulfonált polisztirol gyantán való átvezetéssel tovább tisztítottuk, számos különböző fizikokémiai paraméterrel jellemezhetjük, ideértve a különböző papír- és vékonyrétegkromatográfiás rendszerekben kapott R/ értékeket, amelyek arra mutattak, hogy ez a vegyület valódi egységes termékként viselkedik. Most váratlanul azt találtuk, hogy a teichomycin A2 ténylegesen több, egyidejűleg keletkező, egymáshoz nagymértékben hasonló antibiotikus anyag keveréke, amelynek főbb komponenseit teichomycin A2 1,2,3,4 és 5 faktornak neveztük el. Ugyancsak megállapítottuk, hogy ezek a tiszta egyes faktorok biológiailag megkülönböztethetők a teichomycin A2 komplextől, ugyanis érzékeny mikroorganizmusokkal szemben magasabb antibiotikus aktivitással rendelkeznek. A találmány szerinti antibiotikus anyagokat teichomycinből kiindulva állítjuk elő (amelynek előállítását a fent említett belga szabadalmi leírás mutatja be), oly módon, hogy az antibiotikum komplexet nagyhatékonyságú kromatográfiás módszerekkel felbontjuk az egyes faktorokra és kinyerjük a főbb faktorokat. A jelen találmányi leírásban alkalmazott „teichomycin A2“, „teichomycin A2 komplex“ vagy „antibiotikum komplex“ kifejezés az említett, egyidejűleg keletkező.5 antibiotikus faktort tartalmazó keverékre vonatkozik, amelyet pl. a hivatkozott 839.259 sz. belga szabadalmi leírás kitanítása szerint álíthatunk elő és amelyet abban a leírásban teichomycin A2-nek neveztünk. A komplexnek a főbb tiszta egyedi faktorokra való szétválasztása inverz fázisú megosztási vagy ioncserélő kromatográfiával érhető el. Az előbbi esetben előnyösen inaktívált szilikagélt használunk oszlop-töltetként és gradiens eluciót alkalmazunk, kifejlesztőként acetonitril/vízes ammóniumformiát elegyet vév.e, míg az utóbbi esetben célszerűen gyenge gél-típusú anioncserélőt alkalmazunk stacionárius fázisként és vizes puffereket vagy vizes pufferek és nem-vizes oldószerek elegyeit eluáló rendszerekként. Közelebbről: optimális elválasztási eredményeket érünk el oly módon, hogy a híg vizes ammóniumformiát-acetonitril elegyben oldott teichomycin A2 oldatát szilanizált szilikagél oszlopon engedjük át és az oszlopot gradiens elucióval, ugyanezzel az oldószer-rendszerrel fejlesztjük ki. Jó eredményeket érhetünk el akkor is, ha stacionárius fázisként agaróz-dietilaminoetil-származékot alkalmazunk és a szétválasztást puffer oldatokkal vagy puffer oldatok és vízmentes vízzel elegyedő oldószerek segítségével végezzük, progresszív elucióval. A szétválasztási eljárást HPLC-vel követjük. A hasonló HPLC profillal rendelkező frakciókat egyesítjük, kívánt esetben preparatív HPLC-vel tovább tisztítjuk és sómentesítjük. Ezekből az oldatokból az egyes faktorokat oly módon nyerjük ki, hogy a szerves oldószereket ledesztilláljuk, a vizet kis térfogat eléréséig eliizzük és a kapott termék kicsapására olyan szerves oldószert adunk, feleslegben, a rendszerhez, amelyben a vegyületek nem oldhatók. A találmány szerinti eljárás jobb szemléltetésére a következő konkrét példát mutatjuk be. Ez a példa azonban nem tekinthető olyannak, mint amely a találmányt az itt tárgyalt konkrét körülményekre korlátozza. I. példa A teichomycin A2 1,2,3,4 és 5 faktor szétválasztása 10 gramm teichomycin A2 komplexet — amelyet a 839.259 sz. belga szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint állítunk elő — 1 liter (9:1) 0,2%-os ammóniumformiát:acetonitril elegyben oldunk és a pH-t IN NaOH-dal 7,5-re állítjuk be. Ezt az oldatot egy 500 gramm szilanizált szilikagél 60-at (Merck) tartalmazó oszlopon vezetjük át. Az oszlopot ezután 10 liter össztéríogatű 0,2%-os ammóniumformiát oldattal eluáljuk, acetonítril 10—20% közötti lineáris grádiensének alkalmazásával. Kb. 20 ml térfogatú frakciókat szedünk és ezeket HPLC segítségével vizsgáljuk. A következő I. táblázatban a teichomycin Aj 1,2,3,4 és 5 faktor retenciós idejét (t*) tüntetjük fel, amelyeket egy jellegzetes HPLC elválasztás során mértünk (a műveleti körülményeket a táblázat folytatásaként tűn tétjük fel): I. táblázat Teichomycin Retenciós idő /perc/ A2 faktor 1 21,2 2 22,6 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
