193528. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-21978C ciklusos peptid-acil-származékok előállítására
193528 B. Az A-21978C dezacilezése Az A. utahensis fermentációját az A. fejezetben leírtak szerint hajtjuk végre ferde A. táptalajt és I. szaporító táptalajt használva és a szaporító táptalajt mintegy 67 óráig inkubálva. A fermentációs közeghez nyers A-21978C komplexet adunk (100 g) előállítva a 4,208,403 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint). Az A-21978C komplex dezacilezését Micrococcus luteus-szal végzett próba segítségével követjük. A fermentációt teljes dezaçileződésig folytatjuk; ezt a M. luteus-szal szembeni aktivitás jelzi (körülbelül 24 óra). C. Az A-21978C mag izolálása A B. fejezetben leírtak szerint kapott teljes fermentlevet (20 liter) szűrési segédanyaggal (Hyflo Super-Cel, Johns Manville Corp.) átszűrjük. A micélium eltávolítása után a szűrletet 1,5 liter HP-20 gyantát (DIAION High Porous Polymer, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokyo, Japan) tartalmazó oszlopon bocsátjuk át. A kapott effluenst elöntjük. Az oszlopot ionmentesített vízzel (10 liter) mossuk a szűrtlé maradékának eltávolítása céljából. A mosófolyadékót elöntjük. Ezután az oszlopot 10-10 liter térfogatú víz/acetonitril elegyekkel (95:5, 9:1 és 4:1) eluáljuk, 1 literes frakciókat gyűjtve. Az eluciót analitikai HPLC-vel ellenőrizzük szilikagél/C,8 adszorbenst és 0,1 % ammonium -acetátot tartalmazó víz/metanol (3:1) oldószerrendszert használva, a magot UV monitorral 254 nm hullámhosszon detektálva. A magot tartalmazó frakciókat egyesítve, az acetonitrilt vákuumban lepárolva és a maradékot gyorshűtéssel szárítva 40,6 g félig tisztított A-21978C magot kapunk. D Az A-21978C mag tisztítása A C. fejezetben leírtak szerint kapott félig tisztított magot (15 g) 0,2% ecetsavat és 0,8% piridint tartalmazó 75 ml víz/metanol/acetonitril (82:10:8) elegyben oldjuk. Az oldatot 3,33 liter szilikagél [Quantum LP-1 ]/ /C18 töltetet tartalmazó, 4,7x192 cm-es oszlopra szivattyúzzuk. Az oszlopot a fenti oldószerrendszerrel eluáljuk. 350 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. Az elválasztást 280 nm hullámhosszon UV-monitorral detektáljuk. A magot tartalmazó frakciókat egyesítve, az oldószereket vákuumban lepárolva és gyorshűtéssel szárítva 5,2 g tisztított A-21978C magot kapunk. E. Az A-21978C mag jellemzői Az A-21978C mag jellemzői a következők: (a) Alak: Fehér, amorf szilárd anyag, mely rövidhullámú UV fényben fluoreszkál (b) Tapasztalati képlet: Cfi,Ho,Nl70,,; (c) Molekulasúly: 1465 * (d) Oldhatóság: vízben oldódik (e) Infravörös (IR) abszorpciós spektrum (KBr) maximumok: 3300 (széles), 3042 (gyenge), 2909 (gyenge), 1655 (erős), 1530 (erős), 1451 (gyenge), 1399 (közepes), 1222 (köze11 8 pes), 1165 (gyenge), 1063 (gyenge) és 758 (közepes-gyenge) cm'1 (f) UV abszorpciós spektrum (metanol): UV maximumok 223 nm (e 41,482) és 260 nm (e 8,687) (g) Elektrometrikus titrálás (66% vizes DMF): 4 titrálható csoport jelenlétét mutatja, melyeknek pKu értéke körülbelül 5,2; 6,7; 8,5 és 11,1 (kezdeti pH 6,12). 12 2. preparálás Alternatív eljárás az A-21978C mag előállítására Az A-21978C magot az 1. preparálásban leírt eljárás szerint állítjuk elő, kivéve bizonyos változtatásokat a B. fejezetben. Az A. utahensis tenyészetet először mintegy 48 óráig inkubáljuk; a szubsztrát félig tisztított A-21978C komplex (50 g); a szubsztrát hozzáadása után az inkubálási idő körülbelül 16 óra. A szűrtlevet 3,1 liter HP-20 gyantát tartalmazó oszlopon bocsátjuk át. Az oszlopot 10 térfogat vízzel mossuk, majd víz/acetonitril (95:5) eleggyel eluáljuk. Az eluciót az 1. preparálásban leírtak szerint detektáljuk. 24 liter összegyűjtése után az eluenst felcseréljük víz/acetonitril (9:1) eleggyel. A magot tartalmazó frakciókat ezzel az oldószerrel eluáljuk. E frakciókat egyesítjük, az acetonitril eltávolítása céljából vákuumban bepároljuk és gyorshűtéssel szárítjuk. 24,3 g félig tisztított A-21978C magot kapunk. E félig tisztított magot (24,3 g) vízben (400 ml) oldjuk. Az oldatot 0,2% ecetsavat és 0,8% piridint tartalmazó víz/metar,ol/acetonitril (8:1:1) eleggyel készült 3,33 liter szilikagél [Quantum LP-l]/C,g töltetet tartalmazó 4,7x192 cm-es acéloszlopra szivattyúzzuk. Az oszlopot a fenti oldószerrel körülbelül 13750 kPa nyomáson eluáljuk, 350 ml-es frakciókat gyűjtve. Az eluciót 280 nm-nél UV monitorral detektáljuk. A magot tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldószereket vákuumban lepároljuk és a maadékot gyorshűtéssel szárítjuk. 14 g nagyisztaságú A-21978C magot kapunk. 3. preparálás Nor„-t-BOC-A-21978C C2 és C3 faktorok előállítása A-21978C C2 és C3 faktorok keverékét (10 g) (előállítva a 4 208 403 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi le - írás szerint) vízben (50 ml) oldjuk szonikálás közben (200 mg per ml). Az oldat pH-ját 4,05-ről 9,5-re állítjuk be 5n nátrium-hidroxid-oldat (3,6 ml) segítségével. Di-terc-butil-dikarbonátot (3,0 mi) adunk hozzá és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 2 óráig keverjük. Az elegy pH-ját 9,5-ön tartjuk 5n nátrium-hidroxid-oldat kézi hozzáadásával (6,5 ml lúghozzáadás 2 óra alatt). A reakciót időnként szilikagél TLC-vel ellenőrizzük acetonitril/víz (7:3 és 8:2) oldó5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
