193522. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán proinzulint tartalmazó gyógyszertészeti készítmények előállítására
193522 8 3. példa Izofán protamint és humán proinzulint tartalmazó készítmény előállítása (a készítmény ml-enként40 E humán proinzulint tartalmaz). 10 ml készítmény előállítására az alábbi anyagokat keverjük: humán proinzulin (3,5 E/mg) 114 mg (400 E) desztillált m-krezol 16 mg desztillált fenol 6,5 mg glicerin 160 mg protamin-szulfát 9,6 — 19,2 mg kristályos nátrium-foszfát 38 mg Az elegyhez annyi vizet és 10%-os hidrogén-klorid vagy 10%-os nátrium-hidroxid oldatot adunk, hogy a készítmény térfogata 10 ml és végső pH-ja 7,1 — 7,4 legyen. 4. példa Humán cink proinzulint tartalmazó készítmény előállítása (a készítmény ml-enként 40 E humán proinzulint tartalmaz) 10 ml készítmény előállítására az alábbi anyagokat keverjük: humán proinzulin (3,5 E/mg) 114 mg (400 E) vízmentes nátrium-acetát 16 mg szemcsés nátrium-klorid 70 mg metil-p-hidroxi-benzoát 10 mg cink-oxid 1—8 mg Az elegyhez ennyi vizet és 10%-os hidrogén-klorid vagy 10%-os nátrium-hidroxid oldatot adunk, hogy a készítmény térfogata 10 ml és végső pH-ja 7,2 — 7,5 legyen. A találmány szerinti készítmények biológiai hatását — inzulin készítményekkel összehasonlítva — az alábbiakban ismertetjük: A/ A humán proinzulin perifériás és hepatikus hatása Az ellenőrző vizsgálatokat 10 egészséges kísérleti személyen (5 férfin és 5 nőn) végeztük, életkoruk: 25—40 év (átlagos életkoruk: 29 ± 3 év), átlagos relatív testsúlyuk: 0,96 ± 0,02. Valamennyi vizsgálati időszak előtt a kísérleti személyek legalább 72 órán át olyan, a testsúlyt állandó értéken tartó táplálékot fogyasztottak, amely 45% szén-hidrátot, 40% zsírt és 15% fehérjét tartalmazott. A humán inzulinnal és humán proinzulinnal szemben mutatott, in vivo érzékenységet a DeFronzo, R. A., Tobin, J. D. és Andres R. által leírt [Am.J.Physiol., 237, E214—E223 (1979)), euglikémiás (normális vércukorszint mellett végzett) glükóz-terheléses vizsgálattal határoztuk meg. E vizsgálat során az egyik könyökvénába a vérárammal azonos irányban egy kanült helyezünk, ezen keresztül adjuk be az infúziókat. Ezenkívül a kézfej egyik vénájába is kanült helyezünk, mégpedig a vérárammal ellentétes irányban, ezt a kanült egy melegítő berendezésben (70°C) tartjuk, ezáltal megkönnyítjük a vénás vér7 minták vételét, és arterializált vénás vért állítunk elő. A katéterek elhelyezése után a hormon-infúzió megkezdése előtt legalább félórán át [3—3H]—glükózt infundálunk. A hormon-infúzió megkezdésekor az inzulint vagy proinzulint egy kezdeti, feltöltő dózisban adagoljuk, amelynek koncentrációja logaritmikusán csökken,ezáltal akutan megnöveljük a szérum hormonszintjét. Az ezen kezdeti 10 perces időszakban beadott inzulin vagy proinzulin mennyisége durván kétszerese annak a mennyiségnek, amelyet a következő 10—10 perces időszakokban folyamatos hormon-infúzió formájában adunk be. A szérum glükózszintjét a teljes vizsgálati időszakban 80 mg/dl és 90 mg/d! közötti értéken tartjuk (variációs koefficiens kisebb mint 5%\ oly módon, hogy változó sebességgel 20%-os dextróz-oldatot infundálunk. A vizsgálat során 20 percenként, izotópos módszerrel meghatározzuk a teljes glükóz-felhasználás sebességét. 5 kísérleti személyen előkísérleteket végeztünk, és meghatároztuk, mennyi idő alatt áll be a hormonok biológiai hatásának egyensúlya a humán inzulin vagy humán proinzulin infúziójának megkezdése után. Az egyik napon a kísérleti személyeknek 6 órán át 5,0 pg/ /m2/perc (120 mE/m2/perc) sebességgel infúzió útján inzulint adtunk. A következő napon a kísérleti személyeknek 8 órán át 22,5 pg/m2/perc sebességgel, ugyancsak infúzió útján proinzulint adtunk. A glükóz-felhasználás egyensúlyi sebessége inzulin esetében 3 óra alatt, proinzulin esetében pedig 5 óra alatt állt be. Ezen eredmények alapján az összes további vizsgálat során az inzulint 180 percen át adtuk infúzió formájában, és a hormon biológiai hatásait az összes vizsgálat során a harmadik óra adataiból határoztuk meg. A proinzulin infúziókat 300 percig folytattuk, és a biológiai hatásokat az összes xizsgálatban az ötödik óra mennyiségi eredményei alapján határoztuk meg. Az összes \izsgálatban az utolsó három 20 perces időszak adatait átlagoltuk, és ezt az átlagértéket használtuk, mint az adott vizsgálat adatpontját. Minden kísérleti személyen összesen 8 euglikémiás glükóz-terheléses vizsgálatot végeztünk, e vizsgálatokat más és más napokon hajtottuk végre. Az inzulin hatásának dózis-hatás görbéjét úgy határoztuk meg, hogy az inzulint 15, 40, 120 és 240 mE/m2/perc sebességgel infundáltuk. Ezzel a módszerrel kíséreltük meg, hogy 40 pE/ml és 80 p/ml közötti, egyensúlyi inzulin-koncentrációkat érjünk el (I. táblázat). Ugyanakkor valamennyi kísérleti személynek a proinzulint 4 különböző koncentrációban infundáltuk. A proinzulininfúziók sebességét úgy választottuk meg >2,75, 7,5, 22,5 és 45,0 pg/m2/perc), hogy körülbelül 3.10'12 mól/ml és 50.10-12 mól/ /ml közötti egyensúlyi hormonszinteket érjünk el, vagyis moláris alapon, durván 10-szer akkora értékeket, mint az inzulinnal (1. tábiá-5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
