193516. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hőstabil alfa-amiláz kódoló gén klónozására Eserichia Coli és Bacillus Subtilis
193516 4 előforduló mikroorganizmusban jelen levő plaz mid DNS-re vonatkozik. 2. ) Kiméra plazmid Az ebben a tudományágban általában alkalmazott „kimóra plazmid" szakkifejezés egy rekombináns plazmid DNS-re vonatkozik, amely egy donor mikroorganizmusból és egy megfelelő vektor plazmidból keletkezett, a genetikai technika valamely formájának segítségével. 3. ) Hőstabil alfa-amiláz. Az itt alkalmazott „hőstabil alfa-amiláz" szakkifejezés bármely olyan alfa-amiláz készítményre vonatkozik, amely 90°C-on, pH 6 értéken, kalcium ion jelenlétében 45 percen át tartva megőrzi eredeti aktivitásának legalább 60%-át. 4. ) Alfa-amiláz gén. Alfa-amiláz génnek nevezünk egy olyan DNS darabot, amely a sejten belül termelt alfaamilázt kódolja, valamint magába foglalja a katalitikusán aktív alfa-amiláz szintézisének szabályozásához szükséges információkat is. A találmány szerinti kiméra plazmid előállításához olyan természetesen előforduló donor mikroorganizmus DNS-ét alkalmazzuk, amely mikroorganizmus tartalmaz hőstabil alfa-amiláz enzimet kódoló gént. Megfelelő donor mikroorganizmusok találhatók a termofil baktériumok körében, amelyeket Bacillus stearothermophilus-ként (rövidítve B. stearothermophilus) és Thermus fiavusként (rövidítve T. flavus) osztályoztak. A Bacillus licheniformis (rövidítve B. licheniformis) törzsek szintén megfelelő donor mikroorganizmusok. A B. stearothermophilus törzsek köréből különösen alkalmasak donor-DNS forrásként a következő B. stearothermophilus törzsek: ATCC 31 195,31 196,31 197,31 198,31 199 és 31 783, valamint ezek variánsai és mutánsai, valamint ezek mutánsainak almutánsai. Arra a felfedezésre jutottunk, hogy hőstabil alfa-amiláz enzimeket kódoló génnel rendelkező plazmidok számtalan mikroorganizmusban jelen vannak. A plazmid DNS különösen alkalmas donor DNS-ként, mivel ultracentrifugálás segítségével könnyen tisztítható. Ezt tehát DNS forrást jelent ahhoz a folyamathoz, amelyben az amiláz géneket nagy mértékben koncentráljuk, nagyobb mennyiségű idegen és nem kívánatos genetikai anyagoktól mentesen. Bármilyen vektort, amely összeférhető a gazda mikroorganizmussal, fel lehet használni a találmány szerinti kiméra plazmid képzéséhez. Ezek a plazmidok sokkal könnyebben felismerhetők, ha a vektor hordoz egy markert Különösen hasznos vektorok azok, amelyek antibiotikum-rezisztencia markert hordoznak Az Escherichia coli (rövidítése E. coli) ilyen antibiotikum rezisztenciát hordozó plazmidjai készen rendelkezésre állnak. Alkalmas plazmidok a pBR 322, pBR 325 és pWL 625 plazmidok. A Bacillus subtilis (rövidítése B subtilis) plazmidjai, mint pl a pC 194, amely klóramfe nikol rezisztenciát átruházó gént tartalmaznak, szintén használhatók. 3 Az ilyen vektorok alkalmazásának az az előnye, hogy sokszorozott másolatban léteznek a sejten belül. Ezért ha az alfa-amilázt kódoló gént bevezetjük ezekbe a vektorokba, a gén is sokszorozott másolatban lesz jelen a sejten belül. Ez nagyobb sejtenkénti alfa-amiláz termelést eredményez. Amikor E. coli törzset használunk gazda-organizmusként, további gén-felerősítés is tehetsége. Ezt D. B. Clewel gén-felerősítési módszerével lehet végrehajtani. (J. Bacteriology, 110, 667-676 (1972)). A jelen találmány szerinti kiméra plazmidok létrehozásának első lépése a természetesen előforduló, hőstabil alfa-amiláz enzimet kódoló gént tartalmazó DNS elhasítása a megfelelő restrikciós endonukleázt használva. A donor DNS, amelyet az endonukleázzal elhasítunk, előnyö sen plazmid DNS. Ezt a plazmidot el lehet hasítani akár a kromoszómális DNS-től történő szeparálás előtt, akár az után. Az endonukleáznak olyannak kell lennie, amely a donor DNS-t elhasítja, míg érintetlenül hagyja azt a gént, amely az alfa-amiláz enzimet kódolja. Erre a célra alkalmas endonukleáznak találtuk a Hind III enzimet. A vektort, amely szállítóeszközként működik, és amelybe az alfa-amilázt kódoló gént beillesztjük, szintén el kell hasítani. Ezeknek a vek - toroknak az elhasítására ugyanaz az endonukleáz is alkalmas, amelyet a donor DNS hasításához használunk. A vektort azonban bármilyen endonukleázzal el lehet hasítani, amely lineáris DNS-t alakít ki olyan végekkel, amelyek alkalmasak a donor DNS fragmensek végeivel összekapcsolásra. Az elhasítást a donor DNS és a vektor keverékén is végre lehet hajtani, de az is lehetséges, hogy a donor DNS-t és a vektort különkülön hasítjuk el. Minden esetben lineáris DNS szekvenciák keverékét nyerjük. A donor mikroorganizmusból származó lineáris szekvenci ák némelyike tartalmazza az alfa-amilázt kódoló gént. A donor DNS és a vektor elhasításával nyert lineáris DNS szekvenciákat összekeverjük és összekapcsoljuk, így alakítunk ki egy új plazmidot, a kiméra plazmidot. A lineáris DNS szekvenciák összekapcsolását ligáz segítségével hajthatjuk végre, ez a technika jól ismert ezen a szakterületen. Erre a célra szolgáló hagyományos ligáz a kereskedelemben is rendelkezésre álló T4DNS ligáz. A találmány szerinti kiméra plazmidokat úgy lehet biológiailag aktívvá tenni, hogy átvisszük ezeket egy megfelelő mikroorganizmus gazdasejtbe. Alkalmas gazdaszervezetek pl az amiláz-negatív E. coli törzsek (RR1 és C600), és az amiláz-negatív B. subtilis törzsek (ATCC 31 785 és Bacillus Genetic Stock Center 1 A 289) A transzformáció jól ismert módszerekkel hajtható végre. Ezek a módszerek magukba foglalják a plazmid abszorpcióját a megfelelő sejtben, azaz a CaCÍ2-vel kezelt E. coli sejtekben történő protoplaszt fúziót és abszorpciót. A kívánt plazmidokat tartalmazó sejteket 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
