193512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid emberi leukocita interferonok előállítására
17 193512 18 4. A pLelF H plazmidot Sau 3a és Pst I enzimmel hasítottuk és egy 500 bázispárból álló töredéket különítettünk el. Ily módon olyan gént Kaptunk, amely a 150. számú aminosav és a kódoló szekvencia vége közötti aminosavakat kódolja. 5. A fenti 3. és 4. pont szerint elkülönített töredékeket összekapcsoltuk, és így egy olyan töredéket kaptunk, amely a LelF H 166 aminosavját kódolja: 1 166 met cys asp megállító ATG TGT...--------1-------...GAT TGA ... Pst I Sau 3a 6. A pLelF A trp 25 plazmidot Xba I enzimmel hasítottuk, DNS polimeráz I enzimmel tompavégűvé alakítottuk, majd a terméket Pst I enzimmel feltártuk. A kapott nagy töredéket elkülönítettük, és összekapcsoltuk a fenti 5. pont szerinti termékkel. Olyan termelő plazmidot kaptunk, amely Escherichia coli K-12 294 törzsbe vagy más „gazda” baktériumba transzformálva képes az érett LelF H termelésére. LelF ! Az emberi genom X. fág Charon 4A rekombináns „könyvtárát”, amelyet Lawn es munkatársai hoztak létre [Cell, 15, 1157 (1978)], szűrővizsgálatnak vetettük alá a leukocita interferon génekre vonatkozólag a Lawn és misai (idézett irodalmi hely), valamint Maniatis és munkatársai [Cell, 15, 687 (1978)] által leírt módon. Egy, a cDNS LelF A kiónból származó radioaktív LelF mintát [Goeddel és munkatársai, Nature, 287, 411 (1980)] használtunk közelítőleg 500 000 vérlemezke szűrővizsgálatához. Ennek során hat LelF genom kiónt kaptunk. Ismételt szűrővizsgálat és vérlemezke-tisztítás után e kiónok egyikét ( XHLelF2) választottuk ki a további elemzéshez. A fentebb ismertetett módszer segítségével más mintákat is alkalmazhatunk további LelF kiónoknak az emberi genomból való elkülönítéséhez. Ezek viszont felhasználhatók további leukocita interferon fehérjéknek a találmány szerinti előállítására. 1. A XHLelF2 genom klón 2000 bázispárból 1. álló töredékét alklónozással bevittük a pBR325 plazmidba az Eco Rl helynél. A kapott LelF I plazmidot Eco Rl enzimmel hasítottuk, és elkülönítettük a 2000 bázispárból álló töredéket; A 5 dAATTCTGCAG dezoxioligonukleotidot (Eco RI>Pst I átalakító) hozzákapcsoltuk a 2000 bázispárból álló Eco Rl töredékhez, majd a terméket Pst I enzimmel hasítottuk. így egy 2000 bázispárból álló, Pst I végeket tartalmazó töredé-10 két kaptunk. Ezt Sau 96 enzimmel elhasítottuk, és egy 1100 bázispárból álló töredéket különít tettünk el, amelynek egy Pst I és egy Sau 96 vége van. 2 A pLelF C trp 35 plazmidot kezeltük Pst I 15 és Xba I enzimmel. A nagy töredéket különítettük el. 3. A pLelF C trp 35 plazmid Xba I és Pst I enzimmel végzett feltárásánál képződött kis töré_ déket Xba I és Sau 96 enzimmel kezeltük. Egy 20 40 bázispárból álló, Xba l-Sau 96 töredéket különítettünk el. 4. A fenti 1., 2. és 3. pont szerinti elkülönített töredéket összekapcsoltuk, és ilyen módon a pLelF I trp 1 termelő plazmidot kaptuk. 25 LelF J 1. A pLelF J plazmid az emberi genom dezoxiribonukleinsavból egy 3,8 kilobázisu Hind III töredéket tartalmaz, amely magába foglalja a LelF J génszekvenciát. Ebből a plazmidból egy 30 760 bázispárból álló, Dde l-Rsa I közötti töredéket különítettünk el. 2. A pLelF B trp 7 plazmidot Hind III és Dde I enzimekkel elhasítottuk. Egy 340 bázispárból álló, Hind III és Dde I közötti töredéket különítet-35 tünk el. 3. A pBR322 plazmidot Pst I enzimmel elhasítottunk, DNS polimeráz I (Klenow töredék) enzimmel inkubálva tompavégűvé alakítottuk, és Hind III enzimmel hasítottuk. A nagy (körülbelül 40 3600 bázispárból álló) töredéket különítettük el. 4. A fenti 1,2. és 3. pont szerint elkülönített töredékeket összekapcsoltuk egymással. így a pLelF J trp 1 termelő plazmidot kaptuk A következőkben a fentebb már ismertetett 45 módszereket és anyagokat alkalmaztuk. Az 1 táblázat tartalmazza a hibrid LelF plazmidok előállításával kapcsolatos részleteket. LelF Csszes Kifejeződési Elülső rész hibrid aminosav+ plazmid (vektor) Töredék Aminosavak AD 165 a Xba I-Pvu II rész a pLelF A trp 25-ből (285 bázispár) 1-91 DA 166 a Xba I-Pvu II rész a pLelF D trp 11-től (288 bázispár) 1-92 AD 165 Bgl ll-Pst I nagy töredék a pLelF A trp 25-ből 1-62 DA 166 Bgl ll-Pst I nagy töredék a pLelF D trp 11-ből 1-63 AB 165 a Xba I-Pvu II rész a LelF A trp 25-ből (285 bázispár) 1-91 AF 165 a Xba l.-Pvu II rész a LelF A trp 25-ből (285 bázispár) 1-91 10
