193512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid emberi leukocita interferonok előállítására
13 193512 14 elképzelés, hogy elkülönítsük a pLelF A25-ből egy olyan töredéket, amely tartalmazza a trp promotor-operátor rendszert, a riboszóma kötési helyet és a LelF (A=B) gén kezdetét, s összekapcsoljuk a B szekvencia további részével egy kifejeződő plazmidban. Ahhoz, hogy megkapjuk a közelítőleg 950 bázispárból álló, Sau 3a és Pst I közötti töredéket a 7a. ábrán bemutatott szekvenciából, különböző lépésekre volt szükség egy vagy több zavaró Sau 3a restrikciós hely jelenléte miatt: 1. Az alábbi töredékeket különítettük el: a) Sau 3a és Eco Rl közötti, 110 bázispárból álló töredék; b) Eco Rl és Xba közötti, 132 bázispárból álló töredék; c) Xba és Pst közötti, >700 bázispárból álló töredék 2. A fenti 1.a) és 1.b) töredéket összekapcsoltuk, s Xba és Bgl II enzimmel szétvágtuk, hogy elejét vegyük a Sau 3a és Xba végződéseken keresztüli önpolimerizációnak (ez a Sau 3a hely a Bgl II helyen belül volt, a Bgl II hasításnál tapadós Sau 3a végződés marad vissza). Egy 242 bázispárból álló töredéket különítettünk el. 3 A fenti 2. ponl és az 1 .c) pont szerinti terméket összekapcsoltuk, majd szétvágtuk Pst I és Bgl II enzimekkel, az önpolimerizáció megakadályozására Egy közelítőleg 950 bázispárból álló töredéket különítettünk el, amely a 7a ábrán látható Sau 3a és Pst I közötti résznek felel meg Ez a töredék tartalmazta a LelF B génnek azt a részét, amely nem közös a LelF A génjével 4 A pLelF A25 bői egy közelítőleg 300 bázispárból álló töredéket (Hind III es Sau 3a közötti rósz) különítettünk el, amely tartalmazta a LelF A Irp promotor operator rendszerét, riboszóma kötési helyét, ATG beindító jelét és ciszlein kodonjal 5. A pBR322 plazmidból egy közelítőleg 3600 bázispárból álló, a Pst I és a Hind III között elhelyezkedő töredéket különítettünk el. Ez tartalmazta a replikont, és kódolta a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát, nem kódolta azonban az ampicillinnei szembeni rezisztenciát 6. A 3., 4. és 5. pont szerinti lépésben kapott töredékeket összekapcsoltuk, és a kapott plazmidot Escherichia coli K-12 294 törzsbe transzformáltuk. A transzformált termékeket megvizsgáltuk [Bimbóim és munkatársai, Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979)], és a plazmid mintákat Eco Rl enzimmel hasítottuk. A hasítás három töredéket szolgáltatott: 1) EcoRI - EcoRI trp promotor töredék; 2) pL4 belső EcoRI - EcoRI töredéke, és 3) pL4 EcoRI töredékéig terjedő, fehérje-lefordítást kiváltó startjel. A CPE vizsgálat azt az eredményt szolgál tatta, hogy a fenti módon nyert kiónok bakteriális extraktumaiban az interferonaktivitás 10x106 egység/liter volt As5o=1 értéknél. Egy ily módon előállított jellemző klón az Escherichia coli 294/pLelF B trp 7. További érett leukocita interferonok Más leukocita interferon típusokat tartalmazó további, teljes hosszúságú géntöredékek állíthatók össze és vihetők be kifejeződés-hordozókba, ugyanúgy, mint a LelF A esetén. Az ismert módon történő szekvenciameghatározás feltárja, hogy valamely restrikciós hely elég közel fekszik-e az érett interferon típus első aminosavkodonjához, hogy ezáltal lehetővé tegye az előszekvencia eltávolítását restrikciós hasítással, és az ennek során eltávozott, az N-terminális aminosavakra vonatkozó kodonok pótlását szintetikus DNS töredékekkel való összekapcsolás útján. Ha ez nem lehetséges, Kleid és munkatársai fentebb hivatkozott eljárását alkalmazzuk. Röviden, ennek során az előszekvenciát tartalmazó töredéket pontosan azon a helyen hasítjuk el, ahol az érett polipeptid első aminosavjára vonatkozó kodon kezdődik úgy, hogy 1. a kétszálas DNS-at egyszálas DNS-vá alakítjuk az illető helyet körülvevő tartományban; 2. az egyszálassá alakított tartományhoz egy kiegészítő alaprészt hibridizálunk az egyszálas DNS-ból olyan módon, hogy az alaprész 5’ vége a tervezett hasítási hely melletti nukleotiddal szemközt helyezkedjen el; 3. az 1. pont szerinti művelet során a második szál eltávolított részét helyreállítjuk. Ez a 3' irányban helyezkedik el az alaprészhez képest. A helyreállítást DNS-polimerázzal végezzük, adenint, timint, guanint és citozint tartalmazó dezoxinukleotid-trifoszfátok jelenlétében; és 4. a DNS megmaradt egyszálú részét — amely túlnyúlik a tervezett hasítási ponton — lehasítjuk. A kódoló szál 3' végénél végződő, rövid, szintetikus DNS darab, amely tartalmazza a lefordítást kiváltó ATG jelet, hozzákapcsolható például tompa végződésen keresztül az érett interferonokra vonatkozó, kapott génhez, a gén pedig kifejeződő plazmidba illeszthető, s egy promotor és az azzal kapcsolatos riboszóma kötési hely irányítása alá vihető. Hasonló módon, mint ahogy fentebb ismer tettük, előállítottunk a LelF C-t és a LelF D-t kódoló géntöredékeket az említett interferon típusok közvetlen, bakteriális úton történő kifejező déséhez. Ezeknek a leukocita interferonoknak az előállítása minden esetben egy közelítőleg 300 bázispárból álló töredéken alapult (Hind III és Sau 3a közötti rész), amely a trp promotor - -operátor rendszert, a riboszóma kötési helyet, az ATG beindító jelet és a cisztein kodont tártál mázzá a pLelF A25-ből (s így a LelF A megfelelő részeinek felelnek meg). Ehhez a töredékhez a többi interferon génből nyert géntöredékeket kapcsoltunk, amelyek az egyes aminosav-szekvenciákat kódolták a kezdeti cisztein után, mely mindegyikben megtalálható. Az egyes kapott plazmidokat felhasználtuk az Escherichia coli K 12 294 törzs transzformálásához Az illető gének kialakítását célzó összekapcsolásokat a következőképpen végeztük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
