193512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid emberi leukocita interferonok előállítására
9 193512 10 és így ha termelő plazmidba klónozzuk, a betétet tartalmazó plazmidok lokalizálhatok a tetraciklinnel szembeni rezisztencia visszaállása alapján. Mivel a töredék EcoRI végét kitöltöttük a Klenow polimeráz I enzimes eljárással, a töredéknek egy „tompa" és egy „tapadós" vége van, ami megfelelő irányítottságot biztosít, ha később egy kifejeződő plazmidba illesztjük a töredéket. Ezután a pTrp14 kifejeződő plazmidot készítettük elő a fenti HGH gént tartalmazó töredék befogadására. A pTrp14 plazmidot Xbal enzimmel hasítottuk, majd a kapott tapadós végeket kitöltöttük a Klenow polimeráz I enzimes eljárással, dATP, dTTP, dGTP és dCTP alkalmazásával. Fenolos és kloroformos extrakció, végül etanolos kicsapás után a kapott DNS-at BamHI enzimmel kezeltük, és a képződött nagy plazmidtöredéket poliakrilamidgél-elektroforézissel és elektroelúcióval különítettük el. A pTrp14 plazmidból nyert töredéknek egy tompa és egy tapadós vége van, ami lehetővé teszi a megfelelő irányítottságú rekombinációt a fentebb ismertetett, HGH gént tartalmazó töredékkel. A HGH gént tartalmazó töredéket és a pTrp14 AXba-BamHI töredéket hasonló körülmények között kapcsoltuk össze, mint amit fentebb leírtunk. A kitöltött Xbal és EcoRI végek a tompa végek összekapcsolásával kapcsolódtak össze, a helyreállt mind az Xbal, mind pedig az EcoRI hely Xbal(kitöltött) EcoRI(kitöltött) —TCTAG AATTCTATG— _ —AGATC TTAAGATACEz a szerkezet a tetraciklinnel szemben rezisztens gént is helyreállítja. Mivel a pHGH 107 plazmid tetraciklinnel szembeni rezisztenciát fejez ki a HGH génen túl elhelyezkedő promotor (lac promotor) hatására, ez a pHGH 207 jelzésű szerkezet tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztosító gén kifejezését teszi lehetővé, amelyet a triptofán promotor-operátor szabályoz. Az összekapcsolt terméket Escherichia co li 294 törzsbe transzformáltuk, és 5 (jLg/ml tetraciklint tartalmazó LB táptalajlemezeken választottuk ki a tenyészeteket. A pHGH207 plazmidot EcoRI enzimmel kezeltük, majd poliakrilamidgél-elektroforézissel s azt követő elektroelúcióval egy olyan, 300 bázispárból álló töredéket különítettünk el, amely tartalmazta a trp promotort, operátort és a trp vezető riboszóma kötési helyet, hiányzott azonban belőle a lefordítás kiváltásához szükséges szekvencia. Ezt a DNS töredéket a pLelF A plazmid EcoRI helyéhez klónoztuk. A fenti trp töredék analóg az Escherichia coli triptofán operonnal, amelyből törölve az úgynevezett trp csillapító, a kifejeződés szintjének szabályozható megnövelése érdekében. A módosított trp regulont tartalmazó kifejeződő plazmidokat előre meghatározott mértékben szaporíthatjuk olyan táptalajokon, amelyekben elegendő mennyiségű triptofán adalékanyag van jelen a promotor-operátor rendszer elnyomásához. Ezután triptofán hiányt idézhetünk elő a promotor-operátor rendszer elnyomásának megszüntetésére és a kívánt termék kifejezé- 5 sének biztosítására. Közelebbről az alábbiak szerint jártunk el. 250 p.g pL31 plazmidot hasítottuk Pst I enzimmel, és az 1000 bázispárból álló betétet 6%-os poliakrilamidgélen végzett gélelektroforózissel 10 különítettük el. A gélből elektroelúcióval mintegy 40 p.g mennyiségben nyertük ki a töredéket, és három alikvot részre osztottuk a további feltáráshoz: a) A töredék 16 jo.g mennyiségét részleges 15 hasításnak vetettük alá 40 egység Bgl II enzimmel 45 percig 37“C-on, és a reakcióelegyet 6°/o-os poliakrilamidgélen tisztítottuk. Körülbelül 2 |xg kívánt, 670 bázispárból álló töredéket nyertünk ki. 20 b) Az 1000 bázispárból álló töredék egy másik, 8 jxg mennyiségű részét Ava II és Bgl II enzimmel kezeltük. 1 ^.g mennyiségű, 150 bázispárból álló töredéket nyertünk ki gélelektroforézissel. 25 c) Az 1000 bázispárból álló töredék 16 ^g mennyiségét Sau3a és Ava II enzimmel kezeltük. 10%-os poliakrilamidgélen végzett elektroforézis után közelítőleg 0,25 jxg ( -10 pmól) mennyiségű, 34 bázispárból álló töredéket kap- 30 tunk. HGH gén kiváltás _____ —TCTAGAATTCTATG— —AGATCTTAAGATAC— 35 Xbal EcoRI A két jelzett dezoxioligonukleotidot 5 - -dAATTCATGTGT (1. számú töredék) és 5- -dGATCACACATG (2. számú töredék) a foszfor- 40 savtriészteres módszerrel szintetizáltuk [Maxam és Gilbert, Methods Enzymot., 65, 499-560 (1980)]. A 2. számú töredéket a következőképpen foszforileztük: 200 |xl ( — 40 pmól) (732P) adenozin-trifosz- 45 fátot (Amersham, 5000 Ci(mmól) megszárítottunk és az alábbi összetételű elegyben szuszpendáltunk: 30 jxl 60 mM trisz-hidroklorid (pH=8), 10 mM magnézium-klorid, 15 mM béta-merkapto-etanol, 100 pmól DNS töredék és 2 50 egység T4 polinukleotidVináz. A reakcióelegyet 15 percig tartottuk 37 üC-on, majd 1 jjlI 10 mM adenozin-trifoszfátot adtunk hozzá, és a reagáltatást további 15 percig folytattuk. Ezután a reakcióelegyet 15 perciçjmelegitettük 70 *C on 55 és 100 pmól 5’-OH töredékkel (1. számú), valamint 10 pmól mennyiségű, 34 bázispárbol álló Sau3a Ava II töredékkel kapcsoltuk össze Az összekapcsolást 5 órán át végeztük 4 *C- on a következő összetételű elegyben 50 af 20 60 mM trisz hidrok lórid (pH=7,5), 10mM magnézium klorid, 10 mM ditiotreitol, 0,5 mM ATP és 10 egység T4 DNS ligáz. Az összekapcsolás ulán a reakcióelegyet elektroforézisnek vetettük ala 6% os poliakrilamidgélen, és a 45 bazisparbol 65 álló terméket elektroelúcióval nyertük ki 6
