193512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid emberi leukocita interferonok előállítására
19351? jes aminosav-szekvenciáját vagy annak egy részét kódoló, kétszálas dezoxiribonukleinsav megfelelő kezelésével. Kiválasztunk egy első kétszálas DNS töredéket, amely kódolja egy első, a természetben előforduló leukocita interferon aminosav-szekvenciájának amino végcsoportját, és onnan a 3’ irányban az aminosav-szekvencia jelentős részét. A töredék tartalmaz egy restrikciós endonukleáz hasítási helyet, amely az első leukocita' interferon „n ’ aminosavjára vonatkozó kodönok szomszédságában helyezkedik el — ahol n aminosav alkotja az első interferon aminosav - -szekvenciájának adott részét. A restrikciós endonukleázzal végzett hasítás egy olyan töredéket szolgáltat, amely tartalmazza az első interferon amino végcsoportját és a közelítőleg n aminosavra vonatkozó kodonokat. Ezután egy második töredéket választunk ki, amely egy második, az előzőtől eltérő leukocita interferon aminosav-szekvenciájára vonatkozó összes kodont vagy e kodonok egy részét tartalmazza. Ebben a töredékben jelen van egy azonos restrikciós endonukleáz hasítási hely, amely a második interferon aminosavjaira vonatkozó kodonok szomszédságában helyezkedik el. Itt az aminosavak száma (a második interferon amino végcsoportjától kezdve) közelítőleg 166-n. A második töredéket elhasítjuk a restrikciós endonukleázzal, és ekkor egy olyan terméket kapunk, amely kiegészíti az első töredék hasításával nyert termék végét, és így a két hasítási termék összekapcsolható. Ekkor ismét kialakul a restrikciós endonukleázt felismerő hely, és újból létrejön az első interferon n-edik aminosavjára vonatkozó kodon, ha az eltűnt a korábbi hasítás során A második töredékből a restrikciós endonukleázzal végzett hasítással kapott termék előnyösen a hasítás folytán képződött végtől a 3’ irányban tart azokon a nukleotidokon keresztül, amelyek a második leukocita interferon karboxil 'végcsoportját kódolják. Olyan hibrideket is előállíthatunk, amelyek, kettőnél több, a természetben előforduló leukocita interferon aminosav-szekvenciáinak lényeges részeit tartalmazzák. Ebben az esetben például úgy járunk el, hogy a fentebb említett második töredéket úgy választjuk meg, hogy az egy második restrikciós endonukleáz helyet is tartalmazzon az első után, és ez a második restrikciós endonukleáz hely azonos legyen egy további töredék hasonló elhelyezkedésű helyével, ahol a további töredék egy harmadik leukocita interferon kafboxil végcsoportot tartalmazó részét kódolja stb. A hivatkozott példában a restrikciós endonukleázokkal végzett hasítások során képződött három terméket kapcsolhatjuk össze. Az így nyert hibrid gén az első interferon amino végcsoportot tartalmazó részét, a második interferon aminosav szekvenciájának középső részét és a harmadik interferon karboxil végcsoportot tartalmazó részét kódolja (Egy olyan változat is előállítható, ahol az első és harmadik interferon azonos, és ékkor a hibrid gén az el23 ső interferon karboxil végcsoportot tartalmazó részét kódolja ) A fentebb említett első töredék előnyösen valamely termelő plazmidtól ered, azaz az első leukocita interferon amino vógcsoportot tartalmazó részére vonatkozó kodonokat megelőzi egy ATG vagy más lefordítást kiváltó kodon és egy promotor vagy promotor-operátor rendszer. Ekkor a fenti műveletek végterméke egy olyan plazmid, amelft képes a hibrid gén által kódolt polipeptid termelésére a plazmiddal transzformált baktériumokban vagy más mikrobákban. A találmány szerinti eljárás előnyös változatai szerint a hibrid gének 165-166 aminosavból álló új leukocita interferon aminosav-szekvenciát kódolnak, amely két vagy több leukocita Interferon aminosav-szekvenciájának lénye ges részeit egyesíti. E leukocita interferonok a LelF A, LelF B, LelF C, LelF D, LelF E, LelF F, LelF G és LelF H lehetnek, amelyek szekvenciáit a 3. ábra mutatja be. Különösen előnyösen, a hibrid gének által kódolt új leukocita interferonokban olyan aminosavak vannak jelen és olyan helyzetben, amint azt a 3 ábra All szekvenciája jelzi A találmány szerint kialakított plazmidok által kifejezett termékek vírusellenes aktivitását ismert módon határozhatjuk meg, a biológiai aktivitás vizsgálatánál a következőkben leírtak szerint. A vírusellenes aktivitás meghatározása Escherichia coli K-12 294 törzset önmagában ismert módon transzformáltunk, külön-külön, a következő plazmidokkal: pLelF trp A 25, pLelF trp D, pLelF trp A/D (Bgl II) és pLelF trp D/A (Bgl II). A transzformáns baktériumokat 5- -5 ml L táptalajon tenyésztettük, amely 5 mg/ml tetraciklínt tartalmazott. A tenyésztést addig folytattuk, amíg az A550 értéke 1,0 körüli nem lett. Ekkor az egyes tenyészeteket 5 jxg/ml tetraciklint tartalmazó, 1 liter térfogatú M9 táptalajokra vittük át, és a tenyésztést tovább folytattuk. A sejteket akkor különítettük el, amikor az A550 értéke 1,0 lett, majd a sejt szemcséket 10 ml 15%-os szacharóz-oldatban szuszpen dáltuk, amely 50 mM trisz-hidrokloridot (pH=8,0) és 50 mM etilén-diamin-tetraecetsavat tártál mázott 10 mg lizozimot adtunk hozzá, 5 percig 0“C-on tartottuk, majd a sejteket ultrahanggal kezeltük. A mintakai 10 percig centrifugáltuk Sorvall SM 24 rotor alkalmazásával, l5H00/perc fordulatszámon. A felülúszó folyadékokban jelenlévő interferonaktivitást vírusellenes hatását vizsgáltuk. A 2. táblázatban az 1 liter tenyészet interferonaktivitását tüntettük fel egy emberi sejtvonallal (WISH) végzett titrálás alapján. A táblázatból kitűnik, hogy a LelF A/D aktivitás nagyobb mértékben jött létre, mint a többi interferoné Ezt az eltérést okozhatja a LelF A/D nagyobb aktivitása vagy az, hogy több képződik ebből az interferonból mg fehérjében kifejezve Mivel mindegyik vizsgált interferonnál a genetikai felépítés azonos volt, az látszik a legvalószínűbb 13 24 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
