193512. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid emberi leukocita interferonok előállítására
1 193512 2 A találmány hibrid leukocita interferonoknak dezoxiribonukleinsav rekombinációs technológia útján történő mikrobiológiai előállítására vonatkozik. A találmány szerinti eljárással kapott termékek felhasználhatók vírusos és daganatos megbetegedések kezelésére. Viszonylag homogén leukocita interferonokat eddig egészséges véradók vagy fehérvérűségben szenvedők vérében lévő leukocitákból állítottak elő. Ezek az interferonok fehérjék, és az őket tartalmazó sejteket képesek a vírusok kai szemben ellenállóvá tenni. Emellett az inter férőn gátolhatja a sejtburjánzást, és mérsékel heti az immunreakciót A fenti tulajdonságok arra ösztönöznek, hogy az interferont felhasználják a gyógyászat ban vírusos fertőzések és rosszindulatú daganatok kezelésére Újabban a dezoxiribonukleinsav (DNS) rekombinációs technológiát felhasználták több különféle leukocita interferon mikrobiológiai úton történő termelésére. Az így előállított le ukocita interferonok aminosav-szekvenciája 70% körüli mértékben homológ — egymáshoz viszonyítva [David V Goeddel és munkatársai, Nature, 290, 20 26 (1981)]. A különféle, többek között LelF A,B,C,D,F,G és H jelölésű leukocita interferonok aminosav-szekvenciáit kódoló géneket a KG-1 sejtvonalból állítják elő, amelyet Koeffler és Golde írt le [Science, 200, 1153-1154 (1978)) A KG-1 sejtvonal az American Type Culture Collection gyűjteményben lett letétbe helyezve, s ATCC CRL 8031 számon hozzáférhető Ezek a gének bakteriális kifejeződésére alkalmas plazmidlartalmú hordozókban felhasználhatók a „gazda" baktériumok transzformálására „Gazda" baktériumként előnyösen az Escherichia coli K-12 294 törzset alkalmazzák, amely 1978 október 28-án lett deponálva ATCC 31446 számon. A DNS-rekombinációs eljárások középpontjában a plazmid áll, amely a baktériumokban és más mikrobákban található kétszálú DNS nem-kromoszóma hurok-része, s gyakran sejtenként többszörös kópiában is megtalálható. A plazmid DNS ban kódolt információ tartalmazza azt az információt is, amely szükséges a plazmid újabb sejtekben történő reprodukálásához (azaz „replikon” létrehozásához), és rendszerint egy vagy több olyan kivá lasztási jellemzőnek, mint pl baktériumok esetén az antibiotikumokkal szembeni ellenállókópességnek az átadásához. Ezek a kiválasztási jellemzők biztosítják, hogy a szóbanforgó plazmidot tartalmazó „gazda" sejt kiónjainak növekedése előnyben részesüljön a szelektív tápta lajon A plazmidok hasznosíthatósága azon alapul, hogy specifikus módon hasíthatok egyik vagy másik restrikciós endonukleázzal (vagy restrik ciós enzimmel) Az egyes restrikciós enzimek a plazmidban lévő DNS különböző helyeit „isme rik fel” Ezután heterológ gének vagy géntore dékek illeszthetők be a plazmidba ügy, hogy a végükkel kapcsolódnak a hasítási helyhez vagy az azzal szomszédos rekonstruált végekhez A DNS rekombinációt a sejten kívül végezzük, a létrehozott „rekombináns" plazmid azonban bevihető a sejtbe a transzformációnak nevezett eljárással, és nagy mennyiségben nyerhető heterológ gént tartalmazó rekombináns plazmid a transzformáns szaporítása útján. Továbbá, ha megfelelően történt a gén beillesztése a plazmid azon részeihez képest amelyek a DNS ben kódolt üzenet átírását (transcription) és lefordítását (translation) irá nyitják, akkor a kapott expresszió hordozó fel használható annak a polipeptid szekvenciának a tényleges termelésére, amelyet a beillesztett gén kódol. Ezt a folyamatot kifejeződésnek (expresszió) nevezik. A polipeptid kifejeződése a promotor néven ismert tartományban indul be, amelyet ribonukleinsav (RNS) polímeraz ismer fel és kötődik hozzá Egyes esetekben, például a találmánynyal kapcsolatban előnyös triptofán (trp) promotor esetében, a promotor tartományokat átfedik az „operátor” tartományok, és így kombinált promotor-operátor jön létre Az operátorok olyan DNS szekvenciák, amelyeket felismernek az úgynevezett represszor fehérjék ezek arra szolgálnak, hogy szabályozzák az átírás beindulásának gyakoriságát egy bizonyos piomotornál. A polimeráz enzim végighalad a DNS mentén, és átírja a kódolt spirálágban az 5' végétől a 3' végéig tárolt információt üzenethordozó (messenger) ribonukleinsavvá, amely viszont lefordítódik a DNS által kódolt aminosav szék venciájú polipeptiddé. Minden egyes amtnosa vat egy nukleotid triplett vagy „kodon Kodol azon belül, amelyet ebben a szabadalmi leírás ban szerkezeti génnek nevezünk. Ez az a rész, amely a kifejezett termék aminosav szekven ciáját kódolja A promotorhoz történő kötődés után az RNS polimeráz először átírja azokat a nukleotidokat amelyek egy riboszóma kötési helyet kódolnak majd a lefordítás kiváltása vagy „startjel" követ kezik [ez rendszerint ATG (adenin Mmin gua nin), amely a létrejövő üzenethordozó RNS ban AUG-vé alakul], azután pedig a nukleotid kodo nők jönnek létre magában a szerkezeti génben Úgynevezett megállító kodonok íródnak át a szerkezeti gén végén, amelyek után a polimeráz további üzenethordozó RNS szekvenciát hozhat létre. Ezt a megállító jel miatt a riboszomák nem fordítják le A riboszómák az üzenethordozó RNS-ontalálható kötési helyhez kapcsolódnak — baktériumokban rendszerint amint az üzenethordozó RNS (mRNS) megképzödött — és létrehozzák a kódolt polipeptidet, a lefordítás startjefétol kezdve a fentebb említett megállító jelig A kívánt termék akkor képződik, ha a riboszóma kötési helyét kódoló szekvenciák megfelelően helyezkednek el az AUG indító kodonhoz képest, és ha valamennyi többi kodon követi fázisban az indító kodont. A képződő terméket úgy különítik el, hogy a „gazda” sejtet lízissel 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
