193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
193507 Interferon Messenger RNA in Cell-Free Ribosomal Systems and in Xenopus Oocytes", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72, 4881—4887 (1975)] vagy pedig a mosott sejteket 0,1 mol/1 nátrium-kloridot, 0,01 mol/l trisz-HCl-t (pH= =7,5) és 0,001 mol/l etilidén-diamin-tetraecetsavat tartalmazó elegy („NTE pufferoldat") 400 pl-jében szuszpendáltuk, 2,5 ml 4 molos guanidínium-izotiocianát-oldatot és 1 mol/l ß-merkapto-etanol 20 mmolos nátrium-acetát-oldattal készített oldatát adtuk hozzá és a sejteket homogenizáltuk. A lizátumot egy Beckman SW-60 Ti nitrocellulóz-csőben I, 3 ml 5,7 molos cézium-oldat fölé rétegeztük és 17 óra hosszat centrifugáltuk percenként 39 000 fordulattal az RNS pelletezése és a DNS-től, a fehérjéktől és a lipoidoktó! való elkülönítése céljából, majd fenol-kloroform eleggyel egyszer extraháltuk az RNS-t [vö.: J. Mörser és munkatársai: „Characterization of Interferon Messenger RNA from Human Lymphoblastoid Cells", J. Gen. Virol., 44, 231—234 (1979)]. A kapott teljes RNS-t vizsgáltuk IFN-ßmRNS jelenlétére; a vizsgálat oly módon történt, hogy a vizsgálandó anyagot Xenopus laevis oociták citoplazmájába injektáltuk és meghatároztuk az abban indukált IFN-ß-aktivitást (vö.: Reynold és munkatársai fentebb idézett munkája). Az RNS-t e vizsgálat során vízben oldottuk és mindegyik oocitába körülbelül 50 ni oldatot injektáltunk. Az oocitákat éjjelen át szobahőmérsékleten Barth-féle közegben [vö.: J. Gurdon: J. Embryol. Exper. Morphol., 20, 401—414 (1968)] inkubáltuk, a közeg egy részében homogenizáltuk őket, a sejt-törmeléket centrifugálással eltávolítottuk, majd a szupernatánsban meghatároztuk az IFN-ß-aktivitäst. Az IFN-ß-aktivitás kimutatása a vírusok által indukált citopátiás hatás csökkentése alapján történt [W. E. Stewart és S. E. Sulkon: „Interferon Production in Hampsters Experimentally Infected with Rabies Virus", Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 123, 650—653 (1966)]. Kihívó vírusként vezikuláris sztomatitisz-vírust (Indiana törzs) alkalmaztunk, a sejtek pedig 21-kromoszómára triszómás humán diploid fibroblaszt sejtek voltak, nagyobb IFN^-érzékenység biztosítása céljából. Az IFN-ß-aktivitäst a 69/19 IFN referencia-standardhoz viszonyítva adtuk meg. Az IFN-ß-mRNS-t tartalmazó poli(A)RNS- t a citoplazmás -RNS-ből különítettük el oligo (dT)-cellulózon (típus: 7, a P-L Biochemicals cég terméke) 0,4 mol/l nátrium-kloridot, 10 mmol/1 trisz-HCl-t (pH=7,8), 10 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat és 0,2% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó oldatban szobahőmérsékleten történő adszorpció útján. Rendszerint az összes RNS 4—5%át kaptuk ily módon, a 260 nm-nél mért optikai sűrűség alapján meghatározva. A terméknek a további tisztítását, a poli(A)RNS-nek az IFN-ß-mRNS-ben való dú15 sítása céljából formamid-szacharóz gradiensekkel végeztük [vö.: T. Pawson és munkatársai: „The Size of Rous Sarcoma Virus mRNAs Active in Cell-Free Translation”, Nature, 268, 416—420 (1977)]. Ilyen grádiensekkel sokkal nagyobb feloldást értünk el, mint a nem-denaturáló szacharóz-grádiensekkel. Rendszerint körülbelül 80 pg poli(A) RNS-t 50%-os formamid, 100 mmol/1 lítium-klorid, 5 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsav, 0,2% nátrium-dodecil-szulfát és 10 mmol/1 trisz-HCI (pH=7,4) oldatában oldottunk, az oldatot 37°C hőmérsékletre melegítettük és 2 percig ezen a hőmérsékleten tartottuk, az aggregáció megelőzése céljából, majd egy Beckman SW-60 Ti poliallomer-csőben egy 5—20%-os szacharóz-grádiensre vittük. Ezután 20°C hőmérsékleten, 60 000 percenkénti fordulattal 4,5 óra hosszat centrifugáltuk a Beckman SW-60 Ti rotorban, teljes ”4C-vel jelzett eukariotikus RNS-t alkalmazva méret-jelzőként, majd a grádienst frakcionáltuk és meghatároztuk az egyes frakciók optikai sűrűségét. Az összes RNS-tartalmú frakciókból a terméket 0,5 mól nátrium-kloriddal és 2,5 tf. etanollaj kétszer lecsaptuk és meghatóroztuk a fentebb leírt módon az interferon-mRNS aktivitást. Ezzel a tisztítási eljárással körülbelül 40-szeresre lehetett dúsítani a poli ( A) RNS-ben az IFN-ß-mRNS-tartalmat. Bár úgy látszott, hogy a VGS-sejtekből kapott RNS csak egy, a ß-interferonnal rokon mRNS-frakciót tartalmazott, más sejtvonalakból kapott RNS-ek legalább még egy vagy talán több a ß-interferonnal rokon mRNS-frakciókat látszanak tartalmazni. Ez az utóbbi mRNS nem hibridizál az előbbi mRNS-re, de kódol egy olyan fehérjére, amely IFN-ß-aktivitást mutat és amelyet az autentikus IFN-ß antiszéruma inaktivál. Az ilyen mRNS és más ezzel rokon mRNS-ek hibridizáció útján történő klónozása és expressziója szintén a jelen találmány részét képezi, minthogy az alább leírt eljárások erre is alkalmazhatók. Alternative, az oligo(dT)-hez adszobeált mRNS-t (60 pg) elektroforézis útján frakcionáltuk egy 4%-os poliakrilamid-gélben, amely 7 mol/l karbamidot, 0,1% nátrium-dodecilszulfátot, 50 mmol/1 trisz-borátot (pH=8,3) és 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat is tartalmazott; úgy jártunk el, hogy az mRNS-t feloldottuk ebben a puíferoldatban, majd 1 percig melegítettük 55°C hőmérsékleten és ezután adtuk hozzá a gélhez. Az elektroforézis befejeztével 2 mm széles szeleteket vágtunk a gélből, az RNS-t mindegyik homogenizált gél-szeletből eluáltuk, majd oligo(dT)-eellulózon történő adszorpció útján tisztítottuk tovább a szennyezések eltávolítása céljából, végül a fentebb leírt módon meghatároztuk a kapott termékben az IFN-ß mRNS-tartalmat. Ezen a ponton meg kell jegyezni, hogy még a formamid-szacharóz-grádiensekből és a 16 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
