193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
11 193507 A 3. ábra a klón-szűrési eljárás egyik kiviteli módját szemlélteti, amelyben a találmány szerint előállított DNS szekvencia kerül alkalmazásra. A 4. ábra a humán ß-interferon DNS kódoló szálának összetett nukleotid-szekvenciáját szemlélteti. Ez a szekvencia a betét kezdetétől van számozva, a betét lefordítatlan szakasza felé. A 65—127 számozású nukleotidok egy szignál-szekvenciát képviselnek, a 128—625 számozású nukleotidok pedig az „érett" fibroblaszt interferont képviselik. A szigná 1-polipeptid amínosav-szekvenciáját a megfelelő nukleotid-szekvencia felett ábrázoltuk; a szignái-polipeptid aminosavait —21- tői —1-íg, az érett interferon aminosavait pedig 1-től 166-ig számoztuk. Az 1980. április 3-án bejelentett 80.11306 sz. nagy-britanniai szabadalmi bejelentéssel kapcsolatban letétbe helyezett kultúrákban jelenlevő humán ß-interferon DNS resztrikciós és fragment-analizis adatainak felülvizsgálata arra az eredményre vezetett, hogy az említett nagy-britanníai szabadalmi bejelentés 4. ábráján ábrázolt szekvenciához képest két nukleotidot a jelen bejelentés 4. ábráján feltüntetett módon megváltoztattunk. Ezek a változások a humán ß-interferon DNS javasolt szignál-szekvenciáját megelőző lefordítatlan szekvenciában szerepelnek. Az említett változások nincsenek hatással a humán ß-interferon DNS szekvenciájára, sem transzlációs termékének amínosav-szekvenciájára és nem változtatják meg e szekvenciának felhasználását hibridizációs szondaként a humán ß-interferonnal rokon DNS-betétekhez alkalmazandó klónos szűrővizsgálatára. Az 5. ábrán néhány e találmány szerinti plazmid orientációs és resztrikciós térképét mutatja. A 6. ábr-án összehasonlítjuk a találmány szerinti humán fibroblaszt interferonnak az aminosav-összetételét egy autentikus fibroblaszt interferonéval. A 7. ábra a találmány szerinti humán ß-interferon gén resztrikciós térképét, valamint a ph'FIF3, pHFIF6 és pHFIF7 szekvenciák képzése során alkalmazott szekvencia-képzési stratégiát szemlélteti. A 8. ábra a találmány szerinti pPLa -HFIF-67-1 rekombináns DNS-molekula szerkezetének vázlatos képe. A 9. ábra a találmány szerinti pPLa-HFIF-67-12 és pPLa-HFIF-67-12A19 rekombináns DNS-molekula szerkezeti felépítésének vázlatos képe. A 10. ábra a találmány szerinti pPLc-HFIF-67-8 rekombináns DNS-molekula szerkezeti felépítésének vázlatos képe. All. ábra a találmány szerinti pPLa-HFIF -67-12 rekombináns DNS-molekula orientációjának és részleges resztrikciójának térképe. A 12. ábra a találmány szerinti pPLa-HFIF-67-12A19 rekombináns DNS-molekula orientációs és részleges resztrikciós térképének vázlata. A 13. ábra a találmány szerinti pPLc-HFIF-67-8 rekombináns DNS-molekula orientációs és részleges resztrikciós térképének vázlata. A találmány kivitelezésének legjobb módja: Annak érdekében, hogy az itt leírt találmány jobban megérthető legyen, azt az alábbi leírásban részletesen ismertetjük. A leírásban alkalmazott fogalmak közelebbi magyarázata: Nukleotid: A DNS vagy RNS monomer egysége, ameiy egy cukor- (pentóz-) részből, egy foszfát-részből és egy nitrogéntartalmú heterociklusos bázisból áll. A bázis a gliko- 2id-szénatomon (a pentóz l’-szénatomján) keresztül kapcsolódik a cukor-részhez; a bázis és a cukor ilyen kombinációját nukleozidnak nevezik. A bázis jellemző a nukleotidra. A DNS-ben négyféle bázis szerepel: adenin („A”), guanin („G”), citozin („C") és timin („T"j. Az RNS négyféle bázisa: adenin („A"), guanin („G"), citozin („C”) és uracil („U"). DNS-szekvencia: Nukleotidok lineáris elrendezésű csoportja, amelyben a nukleotidok a szomszédos pentózok 3’-, illetőleg 5’-szénatomjai közötti foszfodiészter-kötésekkel kapcsolódnak egymáshoz. Kodon: Három nukleoíidból álló DNS-szekvencia (triplett), amely mRNS útján egy aminosavat, egy transzlációs indító szignált vagy egy transzlációs terminális szignált kódol. így például a TTA, TTG, CTT, CTC, CTA és CTG nukleotid-triplettek a leucin („Leu") aminosavat kódolják; a TAG, TAA és TGA a transzlációs stop-szignálokat, az ATG pedig a transzlációs indító szignált. Leolvasó-fázis: A kodonok csoportosítása az mRNS aminosav-szekvenciákoa történő transzlációja során. így például a GCTGGTTGTAAG DNS-szekvencia három leolvasó-fázisban exprimálható, ezek mindegyike más-más aminosav-szekvenciát hoz létre: GCT GGT TGT AAG — Ala-Glv-Cvs-Lvs G CTG GTT GTA AG — Leu-Val-Val GC TGG TTG TAA G — Trp-Leu-(STOP) Polipeptid: Aminosavak lineáris elrendezésű csoportja, amelyben a szomszédos aminosavak az a-aminocsoport, illetőleg a karboxilcsoport közötti peptid-kötésekkel kapcsolódnak egymáshoz. Genom: Valamely sejt vagy vírus teljes DNS-je. Ez többek között a genom polipeptidjeit kódoló strukturális géneket, valamint operátort, promotort és riboszóma-kötő és kölcsönhatási (interaction) szekvenciákat, mint például Shine-Dalgarno-szekvenciákat foglal magába. Strukturális (szerkezeti) gén: Egy DNS-szekvencia, amely a saját templátján vagy messenger (küldönc) RNS-jén keresztül egy valamely specifikus polipeptidre jellemző aminosav-szekvenciát kódol. Transzkripció (átírás): mRNS képzése egy strukturális génből. 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
