193507. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonszerű polipeptidek előállítására
193507 Ezután egy diazo-benzil-oximetil-cellulóz (DBM-cellulóz) szilárd mátrixot (vő.: J. C. Alwine és munkatársai: „Method for Detection of Specific RNAs in Agarose Gels by Transfer to Diazobenzyl Oximethyl Paper and Hybridizing with DNA Probes”, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 5350—5354 (1977)] készítettünk J. C. Alwine és munkatársai [„Detection of Specific RNAs or Specific Fragments of DNA Fractionation in Gels and Transfer to Diazobenzyloxymethyl Paper", Methods-Enzymology, 68: Recombinant DNA (R. Wu kiadása) (1980)] módszere szerint. A papír-matrix készítése céljából egy Whatman 540 szűrőpapír-lapot egyenletesen átitattunk egy cm2-ként 2—3 mg 1-(m-nitro-benziloxi)-metil-piridínium-kloridot (NBPC/BDH) és 0,7 mól nátrium-acetát-trihidrátot 28,5 pl vízben tartalmazó oldattal, 60°C hőmérsékleten megszáradásig és még további 10 percig inkubáltuk, majd 30—40 percig 130—135°C hőmérsékleten tartottuk. Az így elkészített lapot vízzel többször mostuk (körülbelül 20 percig, majd acetonnal mostuk háromszor (ismét körülbelül 20 percig) és végül megszárítottuk és ilyen állapotban tároltuk. Ezt a papírt azután egy 20%-os vizes nátrium-ditionit-oldattal (a papír egy cm2-jére 0,4 ml) 30 percig inkubáltuk 60°C hőmérsékleten, időnkénti felrázással. Ezután a papírt ismét mostuk, és pedig négyszer vízzel, egyszer 30% os ecetsavval 5 percig, majd ismét négyszer vízzel; az így mosott papírt oly jéghideg 1,2 molos sósavoldatba vittük át, amelyhez közvetlenül a felhasználás előtt 10 mg/ml friss nátrium-nitritet adtunk; a papír egy cm2- jére 0,3 ml oldatot alkalmaztunk és a papírt 0°C hőmérsékleten 30 percig hagytuk ebben az oldatban, majd jéghideg vízzel kétszer gyorsan mostuk és azután még egy mosást alkalmaztunk 80% dimetil-szulfoxid (spektrofotometriai minőség, a Merck cég készítménye) és 20% 25 mmolos nátrium-foszfát-oldat (pH=6,0) elegyével. Por-matrix készítése céljából lényegileg ugyanezt a módszert követtük, de mikrogranuláris cellulóz-port (Whatman CC31) alkalmaztunk, a fent megadottt mennyiségeket a cellulóz-mátrix megfelelő súlyára számítva alkalmaztuk. Kezdetben por-matrjxot alkalmaztunk, minthogy megkötőképessége nagyobb volt, és így a hibridizáció, a mosás és az eluálás céljaira viszonylag kisebb folyadék-mennyiségek alkalmazása volt szükséges. Ezt követően azonban az egyedi kiónok szűrővizsgálatára papír-matrixot használtunk. Papír alkalmazása lehetővé teszi a vízzel történő hatásosabb eluálást; ez a módszer az IFN-ß mRNS későbbi vizsgálatainak céljaira előnyösebbnek bizonyult. A fenti módon előállított DNS-t 25 mmolos nátrium-foszfát-oldatban (pH=6,0) oldottuk, az oldatot 1 percig melegítettük, majd hirtelen lehűtöttük és négyszeres térfogatú 16 29 dimetil-szulfoxidot adtunk hozzá. A mátrixhoz való kapcsolás (50 mg por-matrix vagy egy 10 mm átmérőjű papír-korong alkalmazásával) rendszerint a hétvégi munkaszünet alatt ment végbe, 4°C hőmérsékleten, folytonos keverést alkalmazva. A DNS-oldat térfogatát viszonylag alacsonyan tartottuk, hogy lehetővé tegyük a mátrixszal való szoros érintkezést és ezáltal növeljük a DNS-nek a mátrixhoz való kapcsolódási hatásfokát. A kapcsolás befejezése után a mátrixot vízzel négyszer és 0,4 n nátrium-hidroxid-oldattal ugyancsak négyszer mostuk 37°C hőmérsékleten, minden egyes mosás 10—10 percig történt és végül ismét vízzel mostuk négyszer szobahőmérsékleten, kétszer pedig hibridizációs pufferoldattal [50% formamid (ionmentesített, a Baker cég terméke), 40 mmol/i piperazin-N,N’-bisz (2-etánszulfonsav) (pH=6,4, „PIPES", a Sigma cég terméke), 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsav, 0,6 mol/1 nátrium-klorid és 0,1% nátrium-dodecil-szulfát] 4°C hőmérsékleten. A kapcsolás hatásosságát 32P rádióaktivitással mértük. 20 jig fenti módon elkészített teljes RNS-t és 50 ng STNV-RNS-t 250 pg hibridizációs pufferoldatban (papír-matrix esetén 50 plben) oldottunk és ezt az oldatot hozzáadtuk a DNS-sel kapcsolt mátrixhoz. A mátrixot ezután 2 percig melegítettük 70°C hőmérsékleten, majd éjjelen át 37°C-on tartottuk enyhe keverés közben. „C" lépés: A hibridizált teljes RNS-DNS elkülönítése a nem-hibridizált teljes RNS-től A por-matrix centrifugálása után a nem-hibridizált RNS-eket eltávolítottuk és a mátrixot hétszer mostuk összesen 2 ml 50% formamidot, 10 mmol/1 PIPES-t (pH=6,4), 1 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat, 0,3 mol/l nátrium-kloridot és 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó oldattal; e mosófolyadékot kisebb sótartalma destabilizálja a nem-specifikus RNS-DNS kötést. Minden egyes mosás után a mátrixot centrifugáltuk, majd ismét szuszpendáltuk a pufferoldatban. Az ezután következő vizsgálat céljaira az első mosófolyadékot egyesítettük a nem-hibridizált RNS-sel („1. frakció"), egyesítettük továbbá a 2—4. mosófolyadékot („2. frakció”) és az 5—7 mosófolyadékot („3. frakció"). A papír-matrixon lefolytatott hibridizációk esetében hasonló módszert alkalmaztunk, azzal az eltéréssel, hogy a mosófolyadékok összes térfogatát 1 ml-re korlátoztuk. „D” lépés: A hibridizált teljes RNS tisztítása A hibridizált teljes RNS-DNS-t a por-matrixról 3 folyadék-adaggal eluáltuk, összesen 900 pl 99% formamidot, valamint 0,2% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó eluáló-íolyadékkal; az eluálást 70°C hőmérsékleten végeztük, majd 2 perc múlva jégbe hűtöttük az eluátumot. A teljes hibridizációs műveletet és a formamiddal történő eluálást lényegileg A. G. Smith módszere szerint (szemé-30 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
