193374. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hordozó-ligandum-komplexek előállítására
3 193374 4 Hidroxilcsoportot tartalmazó hordozóként alkalmazhatunk természetes poliszacharidokat, így agarózt, dextránt, különböző cellulózt, így papírt, cellulózanyagot, cellulózport és cellulóz-gyöngyöt, keményítőt, keményítő-hidrolizátum terméket, kémiailag módosított poliszacharidot és szintetikus polimert, poli(vinil-alkoholt), duolitot, spheront és oligomereket. Előnyös, hogy az alkalmazott (I) képletű klór-hangyasav-észterek könnyen hozzáférhetőek,és az aktíváit hordozó hosszabb tárolásra alkalmas, és így nagymértékű átalakítás lehetséges. A nukleonokkal végzett átalakításokban keletkező hordozó-ligandum-komplexek nagyon stabilak. A ligandumok immobilizálásakor előnyös, hogy a kapcsolódáskor keletkező, vízben jól oldódó N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximid könnyen eltávolítható. A hidroxi-szukcinimid-észterekkel szemben további előnye, hogy a klór-hangyasav-észter-aktívált polimerek hidrolízisekor töltött csoport nem keletkezik, hanem visszamarad' a hordozó eredetileg meglévő hidroxilcsoportja. Az eddig alkalmazott klór-hangyasav-észterekkel szemben az (I) képletű vegyülettel aktivált polimerek hidrolízise kevésbé jut érvényre. Ily módon sikerült a hordozó-ligandum-komplex előállítására eddig ismert módszerek hátrányait a legmesszebbmenőkig elhárítani. A találmányt a következő kiviteli példákkal részletesebben tárgyaljuk. Kiviteli példák A ligandumkötésre példaként az ovomukoid, a concanavalin A (ConA) és glicin kapcsolódását adtuk meg, amikor is a hordozót 18 órán keresztül In NaOH oldattal kezel tűk, majd meghatároztuk Lowry módszere alapján (J. Biol. Chem. (1951) 265) a megkötött protein mennyiségét és a megkötött glicin mennyiségét pedig a (glicinhez adagolt) felhasználásból számítottuk a TNBS-módszer alapján. 1. példa 1 ml vízmentes dioxánban szedimentált. gyöngycellulózhoz (IPOC Teltow, Charge 83/18) 14 ml (I) képletű észter - oldatot (38 mg/ml koncentráció) adtunk. A szuszpenziót három óráig 60°C hőmérsékleten ráztuk. A leszűrt hordozót vízmentes dioxánnal mostuk és összekevertük pH = = 8 és 0,1 mól Na-tetraborát-pufferben készített 1,2 ml ovomukoid-oldattal (az ovomukoid koncentrációja: 8,33 mg/ml hordozó). A kapcsolódás szobahőmérsékleten 2 óra alatt rázás közben lezajlott.Eredmény: l,24mg ovomukoid/ml hordozó. 2. példa Az 1. példához hasonlóan végeztük el a kísérletet, csak szefaróz-Cl-t alkalmaztunk. Eredmény: 2,48 Ovomukoid/ml hordozó. 3. példa Az 1. példához hasonlóan végeztük el a kísérletet Spheron P 1000 alkalmazásával. Eredmény: 1,45 mg ovomukoid/ml hordozó. 4. példa Az 1. példához hasonlóan végeztük el a kísérletet, csak az ovomukoid koncentrációja: 83,3 mg/ml = 100 mg/ml hordozó. - Eredmény: 18,6 mg ovomukoid/ml hordozó. 5. példa Az 1. példához hasonlóan végeztük el a kísérletet, csak az ovomukoid kapcsolódása szobahőmérsékleten két óra alatt, és ezután még 4°C hőmérsékleten 24 óra alatt zajlott le. Eredmény: 7 mg ovomukoid/ml hordozó. 6. példa Az aktiválási körülményeket a következőképpen változtattuk meg: 1 ml gyöngycellulózhoz 3,5 ml (200 mg/ml koncentrációban) észter oldatot adtunk,és a szuszpenziót 80°C hőmérsékleten 6 óráig reagáltattuk. A kapcsolódás 1,2 ml ovomukoid oldat (41,66 mg ovomukoid/ml) adagolásával és szobahőmérsékleten két órás rázással és 4°C hőmérsékleten 22 órás rázással történt. Eredmény: 13,8 mg Ovomukoid/ml hordozó. 7. példa 1 ml gyöngycellulóz aktiválása az 1. példa szerint történt. A kapcsolódáshoz 1,3 ml concanavalin A oldatot = 10 mg concanavalin A-nak pH = 8, 0,1 mól Na-tetraborát-pufferban készített oldatát adagoltuk. Az elegyet szobahőmérsékleten öt órán keresztül ráztuk. Eredmény: 6,7 mg ConA/ml hordozó. 8. példa 1 ml vízmentes dioxánban szedimentált gyöngycellulózhoz (IPOC Teltow, Charge M 83/18) 14 ml (I) képletű észter oldatot (38 mg I/ml) adtunk. A szuszpenziót 60°C hőmérsékleten három órán keresztül ráztuk. A leszűrt hordozót vízmentes dioxánnal mostuk és összekevertük 5 ml glicin oldattal (4 mg/ml = 53,4 pmól/ml), amelyet pH = = 8, 0,1 mól Na-tetraborát-pufferban készítettünk el. Két órás, szobahőmérsékleten végzett rázás után leszívattuk a hordozót, és a felülúszóból meghatároztuk a glicin-felhasználást. Eredmény: 49,3 pmól/ml hordozó. SZABADALMI IGÉNYPONT Eljárás hordozó - ligandum - komplex előállítására, amikor is aktivált hidroxilcsoportot tartalmazó vegyületeken a nukleofil ligandumokat kovalenskötéssel kapcsoljuk, azzal jellemezve, hogy aktíválószerként az (I) képletű N-(klór-karbonil-oxi)-5-norbornén-2,3 - -dikarboximidet alkalmazunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1 lap rajz 3
