193350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-fenil-pirano(2,3-b)piridinek előállítására
193350 6 szereket, amelyek során a találmány szerinti vegyületeket mint vírusellenes szereket alkalmazzuk oly módon, hogy a vírus vagy a vírus-gazdasejt (azaz a sejt, amely hajlamos vírusfertőzésre) egy vagy több tárgyalt vegyület hatásos mennyiségével érintkezik. A jelen találmány olyan vírusellenes készítmények előállítására is vonatkozik, amelyek körülbelül 0,00001 tömegszázalék, vagy kevesebb és körülbelül 99 tömegszázalék közötti mennyiségben tartalmazzák az aktív vegyületet, gyógyszerészeti szempontból megfelelő hordozó anyaggal kombinálva. Jellemző, hogy ezen kombinációkban az aktív vegyületet általában kis százalékban alkalmazzuk, a gyógyszerészeti szempontból megfelelő hordozó folyadék-halmazállapotú, ezért a kompozíció 0,00001 tömegszázalék vagy kevesebb mennyiségű aktív vegyületet tartalmaz, amely ekvivalens egy olyan kompozícióval, amely körülbelül 0,1 pg vagy kevesebb aktív vegyületet tartalmaz a hordozó 1 ml-ére számolva. A szóbanforgó vírusellenes szereket különösen hatásosnak találtuk picorna-vírusokkal, vagyis apró ribonukleinsav-vírusokkal szemben. A picorna-vírusokhoz tartoznak az olyan vírusok, mint az Entero-vírusok, Rino-vírusok és számos, növénybetegséget okozó vírus. Van némi különbség a vegyületek vírusellenes potenciája, illetve a vírusellenes hatás spektruma, valamint a toxicitás, illetve a mellékhatások tekintetében. A tárgyalt vegyületek vírusellenes aktivitásának kimutatására a következő szövettenyészetet alkalmaztuk a tesztelő eljárás során. HeLa sejteket (GIBCO, Grand Island, New York) tenyésztettünk, és 36°C-on tartottunk, Corning 75 cm2-es szövettenyészet-lombikokban, Eagle-féle „minimális nélkülözhetetlen táptalaj”-t Earle-féle sókkal alkalmaztunk és 1% antibiotikum-törzsoldattal egészítettük ki. 7—10% mennyiségű, hővel inaktivált magzati borjú-szérumot adtunk a sejt-tenyészeti táptalajhoz,és a koncentrációt 1—2%-ra redukáltuk a sejt-fenntartóra (táptalaj) számolva. A sejtállományokat folyékony nitrogénben tartottuk és 10—100 közötti „áthaladási szinten" alkalmaztuk. A HeLa sejteket 24-üreges mikrotítráló tányérokra helyeztük át, a koncentráció 1,0— —1,3 x 105 db sejt/üreg 1,0 ml sejt-tenyészeti táptalajban. 24 órai növekedés után — 36°C hőmérsékleten, nedvességet tartalmazó C02- -inkubátorban (5% C02, 95% levegő) — a tenyészeteket 60—75%-os monomolekuláris réteggé alakítjuk, amelyek így felhasználásra készek'voltak. Mindegyik teszt-vegyülétből két gramm mennyiséget 0,1 ml acetonnal elegyítettünk," majd hozzáadtunk 10 ml táptalajt, amelynek eredménye 200 pg vegyület/ml törzs-koncentráció. Ezután hígításokat készítettünk abból a célból, hogy ugyanabban a táptalajban különböző teszt-koncentrációkat kapjunk. A 24-üreges mikrotítráló tányérokban lévő HeLa sejttenyészetekről eltávolítottuk a 5 folyadékot, majd hozzátöltöttük az 1,0 ml, vegyületet tartalmazó, vagy vegyületet nem tartalmazó táptalajt. A megfelelő monomolekuláris rétegeket ezután 0,1 ml (10—100 TCID50) vírussal próba alá vetettük. A sejttenyészeteket 33 vagy 36°C hőmérsékleten, nedvességet tartalmazó C02 inkubátorban inkubáltuk7 és 48,72,illetve 96 órával a próba után mikroszkóppal vizsgáltuk a vegyület citotoxicitását és a vírusos citopatikus hatását (CPE). A vírusos CPE-t a következők szerint minősítettük: — (nincs CPE); +1 (20%-os CPE); +2 (40%-os CPE) ; +3 (60%-os CPE) ; +4 (80%os CPE); +5 (100%-os CPE). A vegyületazon legkisebb koncentrációját tekintjük a vegyület minimális gátló koncentrációjának (MIC50), amely a vírusos CPE-t 50%-kal, vagy még jobban redukálja a kontrolihoz képest. A fenti eljárást alkalmazva, az előállított vegyületeket RV-1A, RV-2, RV-9, RV-39, valamint RV-64 vírussal szemben teszteltük. Mint azt korábban már említettük, az aktivitásban különbségeket észleltünk, de a vegyületek nagy része aktív mindenféle vírussal szemben és az MIC50 érték 1,3 pg/ml, vagy ennél kevesebb. Ebben a tekintetben az alábbi vegyületek kivételek: 6- (butil-tio) -2- (3,4-diklór-fenil ) -3,4-dihidro-2H-pirano [2,3-b] piridin (csak RV-2 és RV-39 vírussal szemben aktív); 3,4-dihidro-6-(metil-szulfonil)-2-fenil-2H-pirano [2,3-b] piridin (csak RV-2, RV-9 és RV-39 vírussal szemben aktív, és sorrendben 2,5, 2,5, illetve 5 pg/ml MIC50 érték jellemzi); 6-bróm-2-fenil-2H-pirano [2,3-b] piridin (csak RV-lA vírussal szemben aktív). A fenti tesztelő eljárás során legaktívabbnak bizonyult vegyületeket egyéb vírusokkal szemben is teszteltük és aktívnak találtuk az alábbi vírusokkal szemben: RV-1B, RV-10, RV-13, RV-21, RV-29, RV-32, RV-33, RV-44, RV-49, RV-55, RV-74, RV-89, RV-Hanks, Echo 6, Echo 12, Echo 30 és Entero 70. A jelen találmány tárgyát képező vegyületeket egérben is teszteltük (400 mg/kg, p.o.) és az egér-szérumokat vizsgálva a teszt-vegyület jelentős mennyiségeinek jelenlétét tapasztaltuk. Az alábbi vegyületek, határozott előnyeik miatt (például széles spektrumú vírusellenes aktivitás a vegyület kis koncentrációja esetén) előnyösen alkalmazhatók vírusellenes szerek hatóanyagaként: 2- (3,4-diklór-fenil) -3,4-dihidro-6- (metil-szulfonil)-2H-pirano [2,3-b] piridin; 6-bróm-2- (3,4-diklór-fenil) -3,4-dihidro-2H-pirano [2,3-b] piridin; 6-klór-2- (3,4-diklór-fenil) -3,4-dihidro-2H-pirano [2,3-b] piridin. A tárgyalt vegyületek használata során a vírus vagy a vírus-gazda-sejt egy vagy több olyan vegyület egy bizonyos mennyiségével érintkezik, amely vírus-gátló hatású. Habár a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
