193311. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anyarozs alkaloidok, főként ergotamin parazita úton való előállítására
1 Í93311 A találmány tárgya eljárás anyarozs alkaloidok, főként ergotamin parazita úton való előállítására, Claviceps purpurea törzs új variánsával. Az anyarozs alkaloidok előállításának két eltérő módja ismeretes; a termesztett drog extrakcióján alapuló eljárások, illetve a steril fermentációs alkaloidtermelés Claviceps törzsekkel. A steril fermentációs alkaloidtermelésre ismeretesek realizált eljárások (150631, 151724, 152239, 164816 számú magyar szabadalmi leírások), ennek ellenére a drogtermesztés nem vesztette el jelentőségét s a világ peptidalkaloid termelésének jelentős hányada mindinkább a különböző alkaloidféleségekre dúsított drogot használja fel. Különösen érvényes ez az ergotamin és az ergokrisztin termelését illetően. Az ergolinvázas alkaloidokat termelő Claviceps purpurea törzs előállítása több korábbi szabadalomnak is tárgya, amelyekben változó módszerekkel igyekeztek magasabb hozamú törzsekhez jutni. így a 232648 sz. szovjet szabadalom olyan eljárást ismertet, amelyben az ergotoxin előállítás céljára spóramérettel és telepmorfológiával jellemezhető Claviceps purpurea törzset állítottak elő. A 155148 sz. magyar szabadalmi leírás eljárása szerint speciális táptalajon, a telep színe alapján lehet ergotamin termelésre képes törzseket előállítani. A 186823 lajstromszámú, 1984. május 9-én megadott magyar szabadalmi leírás eljárást ismertet anyarozs alkaloidok, főként ergotamin, parazita úton való előállítására. A találmány célkitűzése olyan eljárás kidolgozása az ergotamin parazita ütőn való előállítására, amelyben a parazita Claviceps purpurea törzs új variánsa — mesterséges táptalajokon, agar felületen és süllyesztett tenyészetben jól spórázik; — spórái jól tartósíthatok; — spórái életképesek és virulensek, újra tápközegbe juttatva 90—95%-ban kicsíráznak és a rozsra juttatva azt fertőzik, — magas droghozamot biztosít, — a drog főalkaloidként 99,5%-ban ergotamint tartalmaz, és a főalkaloidokon kívül csak jelentéktelen szennyezést. A találmány célkitűzése magasabb ergotamintartalmú törzsvariáns előállítása. Az új törzs előállítását a szelekciós nemesítési mód, valamint a mutációt elősegítő sugárkezelés alkalmazásával végeztük. 2 Akiindulási anyag a 186 823 Isz. 1984. május 9-én megadott magyar szabadalmi leírásban szereplő OKI-nál 00208 szám alatt 1981. október 8-án deponált, főleg ergotamint ter- 5 meló törzs droganyaga. A kiindulási törzsből a morfológiai szempontok figyelembevételével küllemileg megfelelő, nagyméretű, sima felületű szkleróciumo- 10 kát választottunk ki. A kiemelt több szá^ szkleróciumot vékonyrétegkromatográfiás módszerrel analizáltuk. A vizsgálati eredmények alapján azokat az egyedeket emeltük ki, amelyek a legtöbb ergotamint és a 15 legkisebb szennyező mellékalkaloidot tartalmazták. A szkleróciumokból steril darabkákat oltottunk 10%-os maláta-agar táptalajra. A kifejlett tenyészeteket 1200-1500 Gray dózisú rádióaktív gamma-sugárzásnak vetet- 20 tűk alá, amely sugárdózist 12-15 óra alatt juttattuk a tenyészetekhez. Ezt követően a tenyészetekből 10%-os maláta-agar táptalaj felületre szélesztést végeztünk. A sugárkezelt túlélt konidiumokból telepek fejlődtek, 25 melyeket a spórázási készség és a morfológiai szempontok alapján szelektáltunk. A kiválasztott telepek mikroszkópi vizsgálattal ellenőrzött spóráiból szubmersz tenyészeteket készítettünk az 1. példában leírt táptalaj fel- 30 használásával. A folyadékkultúrában legjobban spórázó tenyészetek életképességét, virulenciáját üvegházi kísérletekben ellenőriztük. Izolált körülmények között, antézis előtti állapotban lévő rozsnövények kalászait fer- 35 tőztük, s az így legjobb fertőzési eredményt adó spóratenyészetek felszaporított spóráit vittük szabadföldi kísérletbe. Az egyforma méretű parcellákat azonos spóraszámmal fertőztük. A további kiválasztásnál a parcella 40 terméseredményét és a drog ergotamin tartalmát vettük figyelembe. A legtöbb ergotamint tartalmazó drogból válogattuk ki a továbboltásra kijelölt szkleróciumokat. A szelekciós munkát — a fenti kiválasztási szemig pontok figyelembevételével — további 3 éven át folytattuk. Az új törzset, amelynek intézeti jelzése Bk4/S/1/1964. 1984. december 19-én az Or- 50 szágos Közegészségügyi Intézetben a 00320 szám alatt deponáltuk. Az új törzs a kiindulási tenyészethez képest a spórafermentációban és a drogtermesztésben az alábbi eredményeket adta: Régi törzs Üj törzs Intézet jelzése OKI deponálási száma OKI deponálási ideje Fermentlé spóraszáma /spóra/mm*/ Bk4/S/1/1984 00320 1984.dec.19. 6-7*I05 Bk 4/S/64/1981 00208 1981.okt.8 . 6-7x10S 2
