193266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-glaktozidázt termelő, de invertázt nem termelő mikroorganizmus előállítására
193266 Az ismert és a kereskedelemben kapható pUB 110 plazmidot alkalmazzuk, amely Eco Rl-vel linearizálható. A plazmid egy kanamicin rezisztencia-gélt hordoz, amely a sejteknek rezisztenciát biztosít 20 pg/ml kanamicinnel szemben. Az Eco Rl-vel végzett hasítás és a nagyobb fragmensek elkülönítése útján pBT 100-ból kapott DNS-fragmenst lízissel pUB 110-ből Eco RI-ve1 hasított DNS-hez kötjük. A lízis termékét ismert módszerrel Bacillus subtilis sejtekké transzformáljuk. Az így kezelt, kompetens sejteket 25 pg/ml kanamicint tartalmazó táptalajon kinyerjük. A transzformált anyag ampicillinnel szemben rezisztens sejtjeit az 1. példa 4. pontjában szereplő táptalajra visszük, amelyhez cukorforrásként raffinózt vagy glükózt adtunk. Kiválasztjuk azokat a sejteket, amelyek raffinózt nem hasznosíthatnak, glükózt azonban igen. Azok a sejtek, amelyek raffinózt nem hasznosítanak, ampicillinnel és kanamicinnel szemben azonban rezisztensek, konstitutívan termelnek alfa-galaktozidázt, amint ez az 1. példa 5. pontjában leírt módon p-naftil-alfa-galaktoziddal sejtmentes extraktumban igazolható. Meglepő módon a Bacillus subtilis sejtek képesek ennek az E. coli génnek az exprimálására. 5. példa Alfa-galaktozidáz termelése a pBT 102 plazmidot tartalmazó mikroorganizmus fermentációjával. Az 1. példa 5. pontja szerinti, pBT 102-t tartalmazó, BMTU 2742 E. coli törzset 15 órán át, 37°C hőmérsékleten keverés és levegőztetés közben olyan táptalajon tenyésztjük, amely 1% triptont, 0,5% élesztőkivonatot, 0,2% glükózt és 0,5% nátrium-kloridot tartalmaz és pH-értéke 7,8. Ezután a sejttömeget elválasztjuk, újra szuszpendáljuk és centrifugáljuk. A felülúszó tartalmazza az alfa-galaktozidázt, amelynek aktivitása az oldhatatlan résznek eltávolítása után 15 E/mg oldható protein. 13 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás kofaktorokat nem igénylő, alfagalaktozidázt konstitutívan termelő, invertázt azonban nem termelő mikroorganizmus előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alfa-galaktozidáz gént tartalmazó, E. coli eredetű DNS-t és egy, a transzformálandó sejtekbe bevihető vektort, amely antibiotikum rezisztencia géneket tartalmaz, Sal I. restrikciós endonukleázzal teljesen elbontunk, az alfa-galaktozidáz gént tartalmazó DNS fragmentumai közül elkülönítjük a 4 megadalton körüli relatív molekulasúlyú hasadási terméket, ezt bevisszük az ugyancsak Sál I.-gyel elbontott vektor oldatába és DNS-ligáz jelenlétében rekombináljuk egy rekombináns DNS keletkezése mellett, a kapott rekombináns DNS-t kom petenssé tett sejtekkel inkubáljuk a rekombináns DNS-nek a sejtekben való transzformációja érdekében, a transzformált sejteket egyetlen szénforrásként raffinózt tartalmazó táptalajon tenyésztjük, a képződött antibiotikum-rezisztens telepeket elkülönítjük és lízisnek vetjük alá, a lizátumból elkülönítjük a plazmid-DNS-t, ezt Hind III. vagy Eco I. restrikciós endonukleázzal elbontjuk, a kapott oldatot hígítjuk és DNS-ligázzal kezeljük, a kapott renaturált plazmidot ismét bevisszük a kompetenssé tett sejtekbe, a transzformált sejteket ismét egy szénforrásként raffinózt, valamint antibiotikumokat tartalmazó táptalajon tenyésztjük és elkülönítjük a képződött, raffinózt nem hasznosító telepeket. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alfa-galaktozidáz génként az E. coli DSM 2092-ből származó gént alkalmazzuk. 3. Az l. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns DNS első transzformációjához transzformálható sejtként E. coli sejteket alkalmazunk. 4. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a renaturált plazmidokkal végzett második transzformációhoz transzformálható sejtekként E. coli, Pseudomonas putida vagy Bacillus subtilis sejteket alkalmazunk. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antibiotikum rezisztencia géneket tartalmazó plazmidként pBR 322-t alkalmazunk. 6. Eljárás alfa-galaktozidáz előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-5. igénypont szerint előállított mikroorganizmusok bármelyikét megfelelő tápközegben tenyésztjük és a keletkezett fermentléből az alfa-galaktozidázt elkülönítjük. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként a BMTU 2742 (DSM 2091) jelzésű E. coli törzset alkalmazzuk. 14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 8
