193266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-glaktozidázt termelő, de invertázt nem termelő mikroorganizmus előállítására
193266 formációhoz. Ezeknek egyébként végre kell hajtaniuk a fent az első lépéssel kapcsolatban megjelölt feladatokat is. A második transzformációs lépésben kapott sejteket szelektáljuk, olymódon, hogy ezeket egy pH indikátort tartalmazó komplett táptalajon tenyésztjük, amelyben szénforrásként raffinóz és a megfelelő antibiotikum található. A komplett táptalaj a minimál táptalaj komponensein kívül peptont és élesztőkivonatot tartalmaz. Azok a transzformált sejtek, amelyekben a raffinóz-permeáz és az invertáz gén a kiiktatás következtében már nem fordul elő, a raffinózt nem képesek a sejtekbe továbbítani és ezáltal értékesíteni. Ennek következtében a táptalaj pH-ja a semleges tartományban marad, ami viszont nem vezet színváltozáshoz, flymôdon azok a sejtek, amelyekben ezek a gén-szekvenciák nem kapcsolódtak ki és amelyek raffinóz felvétele és ezt követő elbontása révén savat képeznek, a táptalaj szelektív elszíneződése alapján / pH-indikátor/ megkülönböztethetők és elkülöníthetők. Mivel a közvetlen raffinóz-hasznosításra - a raffinóz-permeáz hatása eredményeként - már nem képes sejtek még mindig képeznek alfa-galaktozidázt, amely a raffinózt elbontja, képződnek telepek a raffinózt nem hasznosító sejtekből is. Különösen előnyösen végezhető a raffinóz-permeáz és invertáz gén-szekvenciákat tartalmazó és nem tartalmazó sejtek megkülönböztetése a Mac Conkey lemezek alkalmazásával / Diíco; pH indikátorként neutrálvöröset tartalmaz/. A raffinózt hasznosító telepek ugyanis ezen vörösre színeződnek, a raffinózt nem hasznosító telepek viszont fehérek maradnak. Ezeket a fehér telepeket elkülönítjük és tenyésztésükre ugyanazokat a szokásos módszereket alkalmazzuk, mint az eljárást megalapozó kiindulási mikroorganizmus esetében. Ennek során kitűnt, hogy az új mikroorganizmusok nagyüzemi léptékben is tenyészthetők és stabijak maradnak. A mikroorganizmusok olyan enzim-aktivitásokat rputatnak, amelyek több nagyságrenddel meghaladják a kiindulási törzsek enzim-aktivitását. A keletkezett enzim invertáz-nyomoktól mentes és kb. semleges pH-értékek mellett képesnek bizonyul a szaccharóz kristályosítási felülúszóiban jelenlevő raffinóz technikailag elfogadható hőmérsékleteken való elbontására. Az enzim nem igényel kofaktorokat, mint Mn ionokat és NAD-ot, stabilnak mutatkozik és a szokásos eljárásokkal — amilyen pl.brómcianiddal aktíváit oldhatatlan poliszacchariddal végzett reakció - hordozón rögzíthető. Az elkülönített enzim helyett maga a mikroorganizmus is rögzíthető a megfelelő hordozón és ebben az alakban alkalmazható a technológiában. Ennek során a permeáz-gén kiiktatása következtében raffinózra átjárhatatlanná vált sejtmembrán a rögzítési eljárás folytán raffinózra ismét permeábllissá válik. Ebben az 4 5 esetben a szokásos rögzítési módszerek alkalmazhatók. Az alfa-galaktozidáz elkülönítése az új mikroorganizmusokból az alfa-galaktozidázok kinyerésére ismert szokásos eljárások szerint végezhető. Egy célszerű eljárás abból áll, hogy a biomasszát szokásos módon - pl. nagynyomású diszpergálással, ultrahanggal való kezeléssel stb. - feltárjuk. Célszerűen a kiindulási mikroorganizmusok vonatkozásában ismert megfelelő feltárási módszereket alkalmazzuk. A feltárás után előnyösen polianionos kicsapást hajtunk végre, amelynek során az alfa-galaktozidáz rendszerint a felülúszóban marad. Polianionként előnyösen polietilénimineket alkalmazunk, különösen ezek közül a közepes molekulasúlyuakat. Az így kapott csapadékból az enzim ammóniumszuífáttal kicsapható, mimellett előnyösen a 0,8-1,6 mól/ 1 ammóniumszulfátnak megfelelő frakciót nyerjük ki. Dialízissel és liofilizálással magas kitermeléssel kapunk egy 90% feletti tisztaságú, technikai célokra megfelelően alkalmazható alfa-galaktozidáz preparátumot. Vektorként a pBR 322 plazmid és transzformálható sejtként E. coli BMTU 2744, DSM 2093 alkalmazása esetén a fent leírt eljárás segítségével egy új mikroorganizmust, az E. coli BMTU 2742, DSM 2091-t kapjuk. Az új mikroorganizmus a következő tulajdonságokkal jellemezhető: A pBT 102 plazmidot tartalmazza; rezisztens 50 pg/ml ampieillinnel szemben és intracelluláris alfa-galaktozidázt termel, amely kofaktorokat nem igényel, konstitutív, de nem termel invertázt. Egyébként nem különbözik az E. coli K-12 törzstől és 37°C-on a szokásos táptalajon tenyészthető, célszerűen levegőztetés mellett. A találmány szerinti eljárással előállított új mikroorganizmusok, amelyeket magas alfa-galaktozidáz tartalom jellemez /adott esetben a teljes oldható fehérje mennyiségének max. 30%-a alfa-galaktozidázból áll/ és ez az enzim a fent említett, különösen előnyös tulajdonságokkal rendelkezik, képesek arra, hogy új tulajdonságaikat más mikroorganizmusokra vigyék át. Egy átviteli lehetőség pl. abban áll, hogy egy, a találmány szerinti eljárással előállított mikroorganizmust egy befogadó mikroorganizmussal együtt tenyésztünk, pl. agaron inkubálunk. Ha pl. a találmány szerinti eljárás 2. transzformációs lépésében olyan E. coli törzset alkalmazunk, amely az RP 4 plazmidot tartalmazza, és amelyet a J. Bacteriol. 108, 1244-1249, 1971 helye ismertet, olyan mikroorganizmus keletkezik, amely az RP 4 mellett a hibrid vektort, így a pBT 103-t is tartalmazza /azaz 2 plazmiddal rendelkezik/. Ez a mikroorganizmus Pseudomonas törzsekkel végzett együttenyésztés során a pBT 103-t könnyen átviszi ezekre a törzsekre. 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
