193151. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gangliozid-származékok és ilyen hatóanyagokat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
193151 A vizsgálatoknál kapott eredmények azt mutatják, hogy a gangliozidok belső észterszármazékai serkentik a neuron sarjadzást, és e származékok aktívabbaknak bizonyultak a gangliozidoknál mind 7 nap, mind pedig 9 nap elteltével. 2. A gangliozid-származékok hatása a neuron membrán (Na+, K+) ATPase enzim aktivitására A gangliozidcknak vagy a gangliozidok belső észter-származékainak a (Na+, K+) ATPase membrán enzimet aktiváló képességét neuron membrán készítménnyel értékelhetjük ki in vitro [J. oí Neurochem., fentebb idézett publikáció). Az alkalmazott anyagok és módszerek a. A patkány agyvelő nyers mitochondrium frakciójának előállítása (P2 frakció) A P2 frakció elkészítéséhez Morgan és munkatársai módszerét alkalmaztuk |Biochem. Biophys. Acta, 241, 737 (1971)]. (Az összes műveletet 0—4 °C-on végeztük, a »X g« értékek az átlagos centrifugális erőre vonatkoznak.) A Charles River cégtől beszerzett Sprague Dawley kifejlett hím patkányok (testsúlyuk 150—175 g volt) fejét levágtuk, az agyvelőt gyorsan eltávolítottuk, és jéghideg izotóniás oldattal mostuk. A kisagy kimetszése után az agyvelőket homogenizáltuk motorral működtetett Teflon-üveg homogenizáló szerkezet segítségével (12 le-fel mozgás, 800 fordulat/perc, a sugárirányú hézag 0,25 mm). A homogenizáláshoz 4 térfogatrész homogenizáló oldatot használtunk (0,32 M szacharóz, amely 1 mM kálium-foszfát puffert és 0,1 nM etilén-diamin-tetraecetsav-dinátriumsót tartalmaz, pH=7,27). A homogén anyagot 10 vegyes %-ra hígítottuk a homogenizáló oldattal, 4 réteg sajtszöveten keresztül szűrtük, és 15 percig centrifugáltuk 1000 x g intenzitással. A kapott szemcsét ugyanolyan mennyiségű homogenizáló oldattal mostuk, mint amenynyit az előbb használtunk, majd a fenti módon centrifugáltuk. Az egyesített felülúszó folyadékokat 25 percig centrifugáltuk 17.500 x g intenzitással (ezeket a gravitációs viszonyokat azért alkalmaztuk, hogy maximális mértékben feldúsuljon a frakció az idegvégződésekben. A szemcsét négyszer mostuk a homogenizáló oldattal, és minden alkalom-13 ma! kilencszeres térfogatú folyadékot használtunk, s 25 percig centrifugáltunk 17.500 x g intenzitással. A végső szemcse, amelyet mint »P2 írak- 5 ciót« említjük, fő komponensekként szét nem tört mitochondriumot és idegvégződéseket tartalmaz. A végső szemcsét homogén módon szuszpendáltuk megfelelő mennyiségű homogeni- 1G záló oldatban a fentebb ismertetett Teflonüveg homogenizáló szerkezet segítségével, és azonnal felhasználtuk a vizsgálathoz. Annak érdekében, hogy elkerüljük a tárolással kapcsolatos hibás eredményeket, használat előtt mindig friss P2 frakciókat készítettünk. A P2 frakció készítmények gangliozid-tartalma 33,9±2,8 (standard szórás) nanomól kötött NeuAc/mg fehérje volt. b. Az ATPase vizsgálata 20 Az ATPase aktivitását spektrofotometriásán mértük Wallick és munkatársai szerint [J. Pharm. Exptl. Therap., 189, 434 (1974)]. A reakcióelegy, hacsak másképpen nem adjuk meg, a következő komponensekből állt: 25 50 mM szacharóz, 0,2 mM etilén-diamintetraecetsav-dinátriumsó (7,4 pH-értékre beállítva), 100 mM nátrium-klorid, 5 mM magnézium-klorid, 10 mM kálium-klorid, 2 mM foszfo- (enol) -piruvát-monokáliumsó (PÉP) o0 (pH = 7,4-re beállítva), 3 mM ATP, 50 mM trisz-hidroklorid (pH = 7,4), 0,33 mM NADH, piruvát-kináz (PK, 30 pg/ml) és laktát-dehidrogenáz (LDH, 10 pg/ml) 3 ml végső térfogatban és 7,2 végső pH-értéken. 35 A reakciót 50—75 pg P2 frakció (mint fehérje) hozzáadásával indítottuk be. A (Na+, K+)ATPase aktivitását úgy kaptuk meg, hogy a teljes ATPase aktivitásból kivontuk a Mg2+-től függő ATPase aktivitást, 40 amelyet 3xl0~5 M ouabain jelenlétében mértünk meg. Az egyes meghatározásokhoz szükséges idő 3—5 perc volt. Az ATPase aktivitását nemzetközi egységekben fejeztük ki (mikromól hidrolizált 43 ATP/mg fehérje/perc). A gangliozid-származékok aktivitását (koncentráció 50 nM) azt követően határoztuk meg, hogy 2 órán át inkubáltuk őket 37°C-on neuron membránokkal. 50 Eredmények Az ATPasç aktivitásával kapcsolatban végzett összehasonlító vizsgálatok eredményeit a 2. táblázatban foglaljuk össze. 14 2. táblázat Gangliozid-származékok hatása a neuron membrán /Na* , Kf/ATPase aktivitására Vegyül et Inkubálási Koncent- /Na*“, K^/ATPase idő hőmérséklet ráció aktivitás nove/nM/ kedése, % Kontroll 120 perc 37°C - 100 Gangliozidok 120 perc 37°C 50 142 Gangliozidok belső észterei 120 perc 37°C 50 174 8
