193150. lajstromszámú szabadalom • Hibridvektor és eljárás hibridvektorok sokszorozódásának és működésének a javítására mitokondriális DNS alkalmazásával
193150 hígítjuk és 26°C-on egy órán át inkubáljuk. Utána a protoplasztokat regeneráló közegre visszük fel. A hibridvektor prokarióta szegmensén lévő', a ß-laktamäz képződését kiváltó gén jelenlétét az alábbi eljárással sikerült kimutat nunk. A protoplasztok regeneráló közegéhez 15 g/1 mennyiségű szorbózt adunk, aminek hatására kicsiny és jól elhatárolt telepek képződnek. A ß-laktamäz kimutatására alkalmas reagensek valamelyikét, például padacot (Schindler és Huber, »Enzyme Inhibitors«, 169—176. /1980/) vagy nitrocefint (O’Callaghen és munkatársai. »Antimicr. Agent Chemoth., 1. 283—288 /1972/) rápermetezünk vagy lágy agar vékony rétegében ráhelyezünk a tenyészetre. Az említett reagensek ß-Iaktamázok jelenlétében jellegzetes színátcsapást mutatnak sárgától vörösre, és ilymódon a transzformált telepek azonosíthatók, mert a Podospora — akár az összes többi eukarióta — nem szintetizál saját ß-laktamäzt. A kimutatási eljárást még érzékenyebbé tehetjük, ha a fentemlített lítikus enzimeleggyel átitatott szűrőpapírt néhány órára a tenyészetre helyezzük. Ezt követően a ß-laktamäz-teszt közvetlenül a szűrőpapíron végezhető el. A transzformált egyedek szelektálásának alapja járulékosan a vektorba épített eukarióta jelzett gén is lehet, például a befogadó törzs auxotrófia irányú mutációjának komplementálása a vektoron lévő megfelelő vadgén segítségével. Az azonosított egyedeket elkülönítjük egymástól és külön-külön tenyésztjük. Kell tartalmazniuk a hibridplazmidot, hiszen annak sokszorozódását és működését a ß-laktamäz-teszt kimutatta. A transzformált egyedekből olyan DNS-t izolálunk, amely sűrűség és restrikciós minta szempontjából a kiindulási hibridplazmidnak felel meg. Az E. coli-ba visszatranszformált DNS ampicillinnel szem' ben rezisztens telepek kialakulását eredményezi. Az ezekből a telepekből nyert plazmid-DNS szekvenciái az eredetileg alkalmazott Podospora-DNS homológjai. A leírt hibridplazmidok tehát Podospora-ban és E. coli-ban egyaránt sokszorozódhatnak és működésbe léphetnek. 4. Acremotiium mt-DNS-ének replikációs pontját tartalmazó hibridvektor előállítása Ha tetszőleges eukariótából replikációs ponttal rendelkező restrikciós fragmenst akarunk nyerni, a Podospora-val kapcsolatban fent leírt, a végső befogadó szervezetében végzett közvetlen transzformációs teszten kívül a Saccharomyces cerevisiae pékélesztőben előszelektálást és végezhetünk. Az eukarióta mikroorganizmus kísérletileg igen könnyen kezelhető; vele kapcsolatban már jól kidolgozott transzformációs rendszer 7 létezik. Az élesztőnek ez a transzformációs rendszerét Hinnen és munkatársai (Proc. Nat. Acad. Sei. US 75, 1929—1933 /1978/) már részletesen leírták. A rendszerhez tartoznak a leucinre auxotróf AH—22 jelű befogadó törzs, valamint az S. cerevisiae vad törzsből származó élesztő-leucin-2-gént tartalmazó vektorok. A találmány értelmében olyan vektorokból indulunk ki, amely nem rendelkezik eukarióta replikációs ponttal. Az ilyen vektorok az élesztőben csak akkor tudnak sokszorozódni, ha replikációs pontot tartalmazó restrikciós fragmensbe integrálódnak. Ezt az eljárást az Acremonium chrysogenum hifás gomba esetén az mt-DNS replikációs pontjának elkülönítése céljából az alábbiak szerint alkalmaztuk: Az Acremonium chrysogenum Gams (= Cephalosporium acremonium Corda: Gams: Cephalosporiumartige Schimmelpilze, Fischer, Stuttgart 1971) mitokondriális DNS-é/26,7 kb nagyságú. A Pstl restikciós enzim három fragmensre bontja: 24,5, 1,85 és 0,53 kb-s. A kapott fragmenseket a szintén Pstl enzimmel vágott pDAMI jelű vektorral (Beach et al.: Natura 284. 185—187 /1980/) a fent leírtak szerint ligáz enzimmel egyesítjük. A pDAMí jelű vektor a pBR325 jelű bakteriális plazmidból (Bolivar: Gene 4. 121 —136 /1978/) és az élesztő-leucin-2-génböl áll. A vektor — eukarióta replikációs pont híján — élesztőben nem tud sokszorozódni. \z AH—22 élesztőtörzsön pDAMI-bői és az nt-DNS fragmenseiből álló hibridvektorral végzett transzformációs kísérletek csak akkor vezethetnek sikerre, ha a beépített fragmens eukarióta replikációs pontot tartalmazott. Az A. chrysogenum PstI/2 fragmense esetén a replikációs pont jelenlétét ki lehetett mutatni, ugyanis a PstI/2 fragmenst tartalmazó hibridvektor nagyon hatékonyan (több, mint 200 transzformált egyed/1 pg DNS) iranszformálja az S. cerevisiae élesztőt. A transzformált egyedekből a szabad plazmid-DNS izolálható, amely a kiindulási DNS- sel azonos. Eszerint a PstI/2 fragmens nyilvánvalóan rendelkezik eukarióta replikációs ponttal. Az eljárás elvileg bármelyik mitokondriáis DNS-sel kivitelezhető. A fordítás elkészítése során az alábbi könyvekre támaszkodtunk: J. D. WATSON »A gén molekuláris biológiája«, Medicina Könyvkiadó Budapest, 1980; > Molekularbiologie«, Meyers Taschenlexikon, VEB Bibliographisches Institut Leipzig, 1974. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás eukarióta és prokarióta szervezetben egyaránt alkalmazható, mitokondriális DNS replikációs ponttal rendelkező hib 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
