193060. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A-39079 antibiotikum S-1faktor előállítására
193060 Csakúgy, mint más szervezeteknél,a Streptomyces spheroides NRRL 15600 jellemzői is változhatnak.Például különböző ismert mutagénekkel, úgymint ultra-ibolya-sugarak, röntgen-sugarak,nagyfrekvenciájú hullámok, radioaktív sugarak és kémiai szerek, az NRRL 15600 törzsből mesterséges variánsok és mutánsok nyerhetők.Az összes, az S-l faktor termelőképességet megtartott Streptomyces spheroides NRRL 15600 természetes és mesterséges variánsok és mutánsok felhasználhatók a jelen találmányban. Az S-l faktor, kloramfenikol,, ciklohexamid.aktifenil és szepticidin előállítása során az említett anyagokat termelő Streptomyces spheroides NRRL 15600 törzset, vagy ennek variánsát vagy mutánsát süllyesztett levegőztetett körülmények, megfelelő táptalajban addig tenyésztjük, míg elegendő antibiotikus aktivitás termelődik. A Streptomyces spheroides NRRL 15600 tenyésztésére használt táptalaj számos táptalaj közül választható. A termelés gazdaságossága, az optimális kitermelés és a termék izolálásának egyszerűsége szempontjából azonban bizonyos tenyész-táptalajokát előnyben részesítünk.így például a nagy-térfogatú fermentációk esetében az előnyös szénforrások közé tartoznak a szénhidrátok, példáül a glicerin és a burgonya-dextrin. Az előnyös nitrogén-források közé tartozik az enzimesen emésztett kazein,gyapotmagliszt, szójaliszt,protein-peptonok és hasonlók.A tenyésztő táptalajban használható szervetlen sók közé tartoznak a vas, kálium, nátrium, magnézium, kalcium, ammonium, klorid, karbonát, szulfát és nitrát ionokat szolgáltató, oldódó sók. Az organizmus növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges nyomelemeket is be kell juttatnunk a tenyésztő táptalajba.Ezek a nyomelemek legtöbbször az organizmus növekedési igényeit kielégítő mennyiségben fordulnak elő szennyezésként a táptalaj egyéb alkotó-elemeiben. Ha a habzás problémát okoz, kívánatos lehet kis mennyiségű (azaz 0,2 ml/1) habzásgátló anyag, úgymint polipropilén glikol, (mólsúly körülbelül 2000) hozzáadása a nagy-térfogatú fermentációs közeghez. Jelentős mennyiségű S-l faktor, kloramfenikol, cikloheximid, aktifenol és szeptacidin előállítására előnyösen a süllyesztett-levegőztetett tank-fermentációt alkalmazzuk. Ezekből az anyagokból kis mennyiségeket rázott-lombikos tenyészettel állíthatunk elő.Mivel az antibiotikum-termelésben megfigyelt időbeli késést általában azzal hozzák kapcsolatba,hogy a nagy fermentorokat az organizmus spóraformájával oltják, ezért előnyös a vegetatív oltóanyag használata. A vegetatív inokulum előállításánál kis térfogatú táptalajt oltunk az organizmus spórás formájával vagy micéliumtörmelékével, így friss, aktívan növő tenyészetet kapunk az organizmusból.A vegetatív, ol-1 hanyagot ezután nagyobb fermentorba viszszük át.A vegetatív oltóanyag készítéséhez használt táptalaj lehet azonos,de lehet a nagyobb fermentorban használttól eltérő is. A Streptomyces spheroides NRRL 15600 törzset 15-37°C közötti hőmérsékleten tenyészthetjük.Az antibiotikum-termelésre optimális hőmérséklet 30°C körül van. Amint az a süllyesztett levegőztetett tenyésztési eljárásoknál szokásos,steril levegőt buborékoltatunk a tenyészeten keresztül.Megfelelő mennyiségű antibiotikum előállításához az oldott oxigén szintjét 30% körül vagy e fölött kell tartani a fermentorban (30°C-on és 105 Pa nyomáson). A fermentáció során az antibiotikum-termelést úgy követhetjük, hogy a fermentléből vett mintákat ezekre az antibiotikumokra érzékeny organizmusokkal vizsgáljuk. A biológiai vizsgálatot kényelmesen automatizált turbidimetriás módszerrel végezhetjük. Az antibiotikum-termelést ezenkívül könnyen követhetjük HPLC-vel, UV detektálással. A süllyesztett - levegőztetett fermentációs körülmények között való előállítást követően az S-l faktort a szakterületen ismert módszerekkel nyerhetjük ki a fermentléből. Az izolálási eljárásban a fermentlét általában először leszűrik, hogy a micéliumot eltávolítsák. A megszűrt fermentlevet ezután tovább lehet tisztítani a kívánt antibiotikum előállítása céljából.Különböző technikákat használhatunk a tisztítás során. A megszűrt fermentlé tisztításának egy előnyös technikája, ha a fermentlé pH-ját 2-re állítjuk, a fermentlevet megfelelő adszorbensen, például nagy porozitású makroretikuláris polimeren megkötjük, a faktort oldószerrel,például acetonitrillel leoldjuk az adszorbensről.az eluátumot besűrítjük,majd újra megfelelő oldószerrel, például etilacetáttal extraháljuk. A további tisztítás során alkalmazhatunk extrakciót, kromatográfiás és/vagy kicsapásos technikát. Egy másik módszer szerint a fermentlében lévő szilárd anyagok, ideértve a táptalaj komponenseit és a micéliumot, használhatók az S-l faktor forrásaként extrakció vagy elválasztás nélkül, de előnyösen a víz eltávolítása után. Például az S-l faktor előállítása után az egész fermentlevet, vagy a szűrt fermentlevet liotifizálással vagy dob-szárítóval szárítjuk, illetve azeotróp desztillálóval és szárítással. A szárított teljes fermentlevet vagy szárított fermentlé szűrletet ezután közvetlenül a takarmány-premixbe keverhetjük. Az A39079 S-l faktor-széles spektrumban gátolja patogén baktériumok, főleg Gram-pozitív baktériumok növekedését.Az V. táblázatban az S-l faktor bizonyos mikroorganizmusok növekedését gátló, agar-hígítással meghatározott minimális gátló koncentrációit foglaljuk. A táblázatban az S-l faktor aktivitását a rifampinéval hasonlítjuk össze. 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
