193053. lajstromszámú szabadalom • Eljárás limfotoxin és limfotoxin-mRNS előállítására
193053 Ismeretes a szakirodalomból, hogy az emlősállatok bizonyos sejtjei, megfelelő stimulálás után, in vitro un. limfotoxinok termelésére képesek [például: Evans, Canoer Immunoi. Immunother., 12., 181-190 (1983); Granger és munkatársai, Biology of the Lymphokines, 141-180. oldal, Academie Press (1979)]. Egy adott fajnál a limfotoxin — in vitro — nem egységes protein: egy sor szubtípusát írták le, melyek molekulasúly, töltés és stabilitás szempontjából különbözőek (lásd például Granger és munkatársai fenti közlését). Humán vonatkozásban például négy limfotoxin osztály különböztető meg molekulasúly szerint: a yLT 10.000-20.000, a ßLT 35.000-50.000, az ciLT 70.000-90.000, és az LT-komplex molekulasúlya 200.000-600.000 közé esik. A limfotoxinok in vitro az alábbi tulajdonságokkal rendelkeznek: a) megakadályozzák a sejtek malignus transz formációját [Evans és munkatársai, Int.J. Cancer 27, 45-49 (1981), Ransom és munkatársai, J. Natl. Cancer Inst. 69, 741-744 (1982)]; b) tumorsejtekre citosztatikus, sőt citolitikus hatást fejtenek ki [Evans és munkatársai, Immunopharmacology, _3, 347-359 (1981)], és c) növelik a tumorsejtek érzékenységét a szervezet sejt-közvetítette immunitásának védekező rendszerével szemben [Evans és munkatársai, Cell. Immunok, 63, 1-15 ( 1981 ), Ransom és munkatársai, Int.J.Cancer., 29, 451—458 (1982)]. A szakirodalomból továbbá az is ismert, hogy a limfotoxin készítmények állatmodellben tumorok regresszióját is élőidézhetik [Kahn és munkatársai, Proc.Soc.Exptl.Biol. Med., 169, 291-294 (1982)]. Ennélfogva a limfotoxinoknak nagy jelentősége van rosszindulatú megbetegedések profilaxisában és terápiájában. A limfotoxinok előállítására eddig megismert eljárások a legtöbb esetben primer sejtekből indulnak ki, például az emberi perifériás vérből vagy mandulákból nyert leukocitakészítményekből [Williams és munkatársai, J.Immunoi., [30,518-520 (1983)], egér lépsejtekből [Aksamit és munkatársai, Infect.Immun., 3fi, 1028-1035 (1982) és Trivers és munkatársai, J.Immunok, 117. 130-135 (1976)], vagy szíriai hörcsög vagy tengerimalac hasüregének leukocitáiból [Evans és munkatársai Int.J.Cancer,_27, 45-49 (1981)]. Ezeket a sejteket először nagymolekulájü mitogénekkel, például fitohemagglutininnel kell inkubálni, hogy a limfotoxin termelése meginduljon.így eddig a B-limfocita sejtvonal tenyészetek felülúszóiban csak igen kis limfocita aktivitás volt kimutatható. [Grenger és munkatársai, J.Immunok, 104, 1476 (1970) és Amino és munkatársai, J. Immunok, 113, 1334-1345 (1974)]. Minthogy a limfotoxinok termelésére eddig alkalmazott módszerekkel csak kis mennyiségeket, alacsony tisztasággal lehetett előállita-1 2 ni, az eddig előállított limfotoxinokat nem lehetett sem homogenitásig tisztítani, sem megfelelő mennyiségben antineoplasztikus hatásának állatmodellen történő szélesköjü vizsgálatok céljára hozzáférhetővé tenni. így eddig még biológiailag aktív limfotoxin-mRNS-t sem lehetett kimutatni; márpedig ez a feltétele a limfotoxin gén molekuláris klónozásának a géntechnológia módszerei segítségévek A jelen találmánynak fentiek szerint az az alapfeladata,hogy eljárást szolgáltasson megfelelő mennyiségű és tisztaságú limfotoxin és limfotoxin-mRNS előállítására. Találmányunkban megállapítjuk, hogy a majmok — különösen a Saguinus faj — T-limfocita 1670 sejtvonala, melyet vírus fertőzés segítségével — herpes vírussal, mint a Herpes vírus saimiri vagy Herpes vírus ateles — in vitro vagy in vivo transzformálunk és folyamatos tenyészetben fenntartunk, megfelelő tápoldatban spontán, azaz további indukció nélkül, tekintélyes mennyiségű limfotoxint és limfotoxin-mRNS-t termel. Megállapítottuk továbbá, hogy ha úgynevezett stimulátort adunk a tenyészethez, például valamilyen irodalomból jól ismert daganatkeltő anyagot, például diterpén származékot,előnyösen Tiglian- vagy Daphnan-típusút, ilyen a mezerein (a Daphne mezereum = farkasboroszlán nevű növény kérgének alkotórésze), vagy egy forbol-észtert, előnyösen a 12-0-tetradekanoil-főrből- 13-acetátot [=TPA; Diamond és munkatársai, Advances in Cancer Research, 32. kötet, 1-74 oldal, Academic Press (1980); Hecker, Carcinogenesis, IT. kötet, Mechanisms of Tumor Promotion and Carcinogenesis, 11-48 oldal, Raven Press, New York (1978)] 1-1000 ng/ml koncentrációban, akkor a limfotoxin és limfotoxin-mRNS termelés megnövekszik. Tápoldatként számításba jöhetnek a szokásos szérummentes és szérum tartalmú tápoldatok, például az Eagle féle Minimum Essential Medium (Eagle MEM) vagy a Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 (RPMI1640), melyekhez fetális borjúszérumot és antibiotikumokat is adhatunk. Előnyös a penicillin és a streptomicin és a fetális borjúszérum 10%-ig. Az előnyös találmány szerinti eljárás limfotoxin proteinek termelésére a következő: szérum tartalmú — meghatározott körülmények között szérummentes is lehet — tápoldatban —például RPMI1640 oldatban — melyhez 10-100 ng/ml TPA-t vagy mezerein-t adunk stimulátor gyanánt, transzformált sejteket tenyésztünk 1-7 napig, előnyösen 3-4 napon át, majd a képződött limfotoxint a tenyészet felülúszójából — ismert módszerekkel — elválasztjuk, koncentráljuk és tisztítjuk. Különösen előnyösen úgy végezzük ezt az eljárást, hogy a sejteket a szérúm tartalmú tápoldatból a kezdeti elszaporítás után kevés szérumot tartalmazó, vagy még előnyösebben, szérummentes tápoldatba visszük át. 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
