192993. lajstromszámú szabadalom • Eljárás albicidin antibiotikum előállítására
7 192993 8 A mikroorganizmust körülbelül 15-37 °C között tenyészthetjük, de a legjobb növekedést és albicidin-kitermeléBt mintegy 28- -30 °C között kapjuk. Az albicidin maximális termelése a korai stacioner fázisban következik be az előnyösen 28-30 aC-on tenyésztett kultúráknál. A fermentálást laboratóriumi szinten rázott palackokban, például Fernback- vagy Erlenmeyer-lombikokban hajthatjuk végre. A lombikokat rázatjuk vagy lengetjük a fermentáció folyamán. Az antibiotikum ipari szintű termeléséhez keverővel és levegöbevezetó csővel ellátott steril, rozsdamentes acél fermentációs tartályokat használunk. A fermentálást körülbelül 80-150 órán át folytatjuk; a maximális antibiotikum-termelés körülbelül 90-110 óra között következik be. A fermentáció során a tápközeg alikvotjából határozzuk meg az antibiotikum-koncentrációt. A próbához mikroorganizmusként Escherichia coli UHPl-et használunk, mely a „University of Hawaii, Department of Microbiology "-tói kapott prototróf, vad-típusú törzs. Egyéb E. coli törzsek is használhatók. Mivel az X. aibihneans a fermentálás során valint termel, az E. coli törzset a valin nem gátolhatja. Más mikroorganizmusok, mint Bacillus subtiUs is alkalmazható a próbához. A gátló aktivitás mennyiségi próbájához „glucose minimal A agar”-ból álló 10 ml alaprétegeket (1. példa) öntjük 9 cm-es Petri-csészékbe és 48 óráig 25 °C-on száradni hagyjuk. Ezután a lemezekre rárétegzünk „glucose minimal A medium’’-ban levő, log-fázisú E. coli UHPl-et (2 ml; 2.107 sejt per ml) és 65 °C-on megolvasztott 2 ml 2% „Difco Noble Agar"-t. Az antibiotikus preparátumok sorozathígításának vizsgálata céljából 20 pl térfogatot mérünk be a felülrétegzett lemezekbe vájt 5 mm átmérőjű lyukakba. A gátlási zónákat 37 °C-on való 12 órás inkubálás után értékeljük. A 3 mm széles gállási zónát eredményező antibiotikum-mennyiséget önkényesen 1 aktivitás egységnek nevezzük. A legkisebb gátló koncentrácó (MIC) folyékony tenyészetben megközelítőleg 1 egység/20 pl-nek felel meg a lemezpróbában. Összehasonlító vizsgálatokban standard készítményeket is alkalmazunk, mivel a dózis/hatás görbe lejtését a vizsgálati körülmények csekély változásai is befolyásolják. A fermentáció befejezése utón a baktériumsejteket elválasztjuk az antibiotikus lápközegtől. A tépközegból az antibiotikumot gyantán való adszorpciós kromatográfiával nyerjük ki. A sejteket a tápközegtöl legjobb centrifugálással elválasztani, bár alkalmas szúróanyagon szűréssel is szeparálhatók. Az elválasztott és mosott sejtekben ultrhangos kezelés után antibiotikus aktivitás nem mutatható ki. Az antibiotikumot a sejtmenles tápközegből kromatográfiás gyantán, mint közepes polaritású polimer alkilészter adszorbensen való megkötés útján nyerjük ki. A használható gyanták közé tartozik az Amberlite XAD-7 vagy XAD-8 (Rohm and Haas). Az antibiotikumot a gyantáról rővidszénléncú alkohollal, előnyösen metanollal eluáljuk és az eluótumol bepároljuk. A vizes antibiotikum koncentrátumol acetonnal 95 térfX acetonlöménységig hígítjuk és hidegben (körülbelül 5 #C) tároljuk. A kivált nagymolekulasúlyú inaktív szennyezéseket elválasztjuk és a folyékony fázist az aceton eltávolítása céljából bepároljuk. A koncentrátumot metanollal vagy más oldószerrel hígítjuk, és gélszüréssel és fordított fázisú HPLC-vel tovább tisztítjuk. A gélszűrést alkalmas gél, mint Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals) segítségével hajtjuk végre. Az LH-20 gélszűrés után az antibiotikus aktivitást egyetlen csúcs formájában kapjuk meg. Ennek anyagát fordított fázisú HPLC-vel makroretikuláris gyantaoszlopon, például Hamilton PRP-1 oszlopon tovább tisztítjuk. A legtisztább albicidinhez további fordított fázisú HPLC-vel jutunk oktadecil-szilánozott, például Beckman ODS oszlopot használva. A fordított fázisú HPLC-nél előnyösen izokratikus elúciól alkalmazunk, 1 térf% eceteavat tartalmazó 44 térf% tetrahidrofurán/viz rendszert használva. A HPLC-vel elválasztott baktériumellenes komponensek főkomponense az albicidin és az ös8zaktivitásnak mintegy 80%-ál tartalmazza. Az albicidinl a HPLC-eluátumból úgy nyerjük ki, hogy az aktív csúcs egyesített frakcióiból a tetrahidrofuránt lassan elpárologtatjuk és a fehér kristályos albicidint szűréssel összegyűjtjük. A kristályos albicidin kromatográfiásan tisztának látszik kötött fázisú töltetet (oktadecil-szilán-, ciano- és rendcsoportokkal rendelkező felület) tartalmazó analitikai HPLC oszlopokon. A találmány szerint előállított albicidin antibiotikumként alkalmazható. Az albicidin gátolja emberi éa állati kórokozók fejlődését. A következő 1. táblázat az albicidin in vitro aktivitását muatatja jellemző Gram-pozitív és Gram-negalív mikroorganizmus törzsekkel szemben, agarhígításos módszerrel meghatározva. 1. táblázat Albicidin in vitro aktivitása Kísérleti organizmus Törzs MIC (Mg per ml)' Staphylococcus aureus XI.l 1.6 S taph ylococcu s aureus V41 0.4 Staphylococcus aureus X400 25+ r> 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
