192989. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fiziológiailag aktív hormon készítmények előállítására
6 192989 7 például a száj és körömfájás elleni vakcinákkal együtt adagolhatjuk. A találmány szerinti eljárásokat a következő nem korlátozó példákon keresztül mutatjuk be részletesen. A példákban alkalmazott rövidítések Jelentése: hGH humán növekedési hormon hCS humán chorionic somatomammotropin hPRL humán prolactin bGH szarvasmarha növekedési hormon MAB monoklonális antitest PBS foszfáttal pufferolt sóoldat PMSF fenil-metil-szulfonil-fluorid lg immunoglobulin MHC fő hlstocompatibilis komplex SPRIA szilárd fázisú radioimmunovizsgálat WtD súly 0 időpontban SDS-PAGE SDS poliakrllamid gél elektroforézis EDTA etilén-diamin tetraecetsav RIA radioimmuni vizsgálat Statisztikai kiértékelések: A számtani középértékeket és standard deviációt az ismert módszerek alapján számítottuk. Az egyes csoportok közötti különbségeket az Ismert Student-féle páratlan vizsgálattal határoztuk meg. Az ábrák leírása: 1. ábra az A példára vonatkozik és a törpe egereknél a találmány szerinti készítménnyel elért súlytöbbletet mutatja; 2. ábra a C példára vonatkozik és a normál egereknél elért súlytöbbletet mutatja; 3. ábra a D példára vonatkozik és a galamb-begy súlytöbbletet mutatja; 4. ábra az E példára vonatkozik és a selyemmajom esetében mért súlytöbbletet mutatja. Készítmény előállítási példák 1. példa Humán növekedési hormon (hGH) elleni monoklón antitest előállítása A kísérletnél alkalmazott antitesteket igen kiterjedten jellemezték [Iványi J.: Monodon Hybrídoma Antibodies, Techniques and Appliecations, (ed. Hussel, J.G.R.) CRC Press, Cleveland, Ohio, 1982, 59-79; és Iványi J.: Mól. Immunoi. 19, 1982, 1611-1618] és a következő helyen beszerezhetők: Wellcome Diagnostics, Temple Hill, Dartford, Kent, UK. (Dr.C. Milstein, MTC Laboratory of Mol. Biol. Hills Road, Cambridge, UK) BALB (c egérlép sejteket NSI myeloma sejtekkel) egyesítettünk és ismert eljárások szerint klónoztuk (Iványi J. és Davis P.: Mól. Immunoi. 17, 1982, 287-290, és Protides of the Biol. Fluids 29, Colloquium, 1981). A kapott antitestek mindegyike IgGt izotípusú, és nem precipitálódnak, amikor kettős diffúzióval vizsgáljuk agaron. A kompetiticiós vizsgálattal négy determinánst határoztunk meg hGH-n (QA68, NA71, EB01 és EB02), amelyek közül kettő teljesen részt vesz a hCS-hormonban is. Egyik antitest sem lép keresztreakcióba a prolactinnal. Az antitestek koncentrációját ABT50 értékben fejeztük ki, amely reciprok értéke annak az antitest koncentráció értéknek, amely a 125J-hGH 50X-os megkötéséhez szükséges [RIA-eljárással meghatározva, Iványi J.: Monoclonal Hybridoma Antibodies, Techniques and Applications (ed. by Hussell, J.G.R.) CRC Press, Cleveland, Ohio (1982) 59-79]. A kötési tulajdonságokat protelitikusan módosított formájú hGH-val vizsgálva, megállapítottuk, hogy mind a négy determináns az EB01 determinánssal együtt az első 1-139 gyökön helyezkedik el, a még megtalálható a 146-191 szekvencia szakaszban is. (Aston, R és Iványi J.: The EMBO Journal 2, 493-497, 1983). 2. példa EB01 F ab' fragmensének előállítása EB01 ascites globulinját (5 mg/ml) affinitásosan tisztítottuk, CNB-aktivált Sepharose-n immobilizált 100 mg hGH-on. A megkötött anyagot glicin-sósav pufferrel (pH 2,3) eluáltuk és a csövekben levő fehérjeanyag pH értékét rögtön 7,5-es értékre állítottuk be 1 mólos NaOH-dal. A tisztított antitesteket ezután 20 mg/ml koncentrációra (2 ml) betöményítettük és 0,01 mól ciszteint és 0,002 mól EDTA-t tartalmazó 0,5 mólos, 8,0-as pH-jú nátrium-foszfáttal szemben dializáltuk. Az így kapott anyagot 4 órán át 37 °C-on 0,4 mg papainnal emésztettük, majd a cisztein és az EDTA eltávolítására PBS-sal szemben dializáltuk. Ezt követően a dializátumot DEAE töltetű oszlopon (20 cm x 1,2 cm) kromatografáltuk, eluálószerként lineáris gradiensű nátrium-foszfát puffert (0,005 mól-0,3 mól, pH 8,0) alkalmazva. Az oszlopról levett első csúcs nem tartalmaz antitest nehéz láncot (heavy chain) (SDS-PAGE eljárással meghatározva), és aktivitása 10-3 x ABTso. 3. példa Hormonok Az injekciózás céljára alkalmazott humán növekedési hormont lejárt klinikai minőségű anagokból nyertük (Institute of Child Health, London), a hormon tisztasága 99X. A hGH beszerezhető: RIA(UK)Ltd., Washington, Co. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
