192971. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-51568 A-faktor és B-faktor antibiotikumok előállítására
23 192971 24 daságos termelés, az optimális kinyerés és a termék könnyű elválasztása szempontjából azonban bizonyos táptalajok előnyben részesülnek. Ezek a táptalajok asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat, valamint szervetlen sókat tartalmaznak. Alkalmas szénforrás a burgonya dextrin, melasz, glükóz, szacharóz, laktóz, maltóz és keményítő. A szénforrás optimális koncentrációja: 2-5%. Előnyös nitrogénforrás a nátrium-glutamát, hús pepton, nátrium-nitrát, ammónium-nitrát, ammónium-szulfát, szójapor és élesztő. A mikroorganizmus növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges nélkülözhetetlen nyomelemek a táptalaj más alkotórészeiben mint szennyezések megfelelő mennyiségben megtalálhatók. Kedvező hatásó lehet azonban, ha a táptalajhoz olyan oldható szervetlen sókat adunk, melyek nátrium, kálium, magnézium, kalcium, ammonium, klorid, karbonát, foszfát, szulfát, nitrát, stb. ionokat szolgáltatnak. Nagy méretű fermentálásoknál, ha habzás lép fel, szükséges lehet kevés mennyiségű (0,2 ml/l) habzásgátló, például propilén-glikol adagolása. Noha kis mennyiségű A-51568 A- és B-faktort rázott lombikos tenyészetekből is kaphatunk, az antibiotikum keverék nagyobb mennyiségének előállítására fermentációs tartályokban végzett süllyesztett, aerob fermentációt használunk. Nagy tartályban történő fermentálásnál előnyös a vegetatív inokulum használata. A vegetatív inokulumok elkészítéséhez kis térfogatú táptalajt spórával vagy micélium töredékkel oltunk be, hogy friss, aktívan növekvő tenyészethez jussunk. A vegetatív tenyészetet aztán átvisszük a nagy tartályba, ahol megfelelő inkubációs idő alatt az A-51568 antibiotikum keverék optimális hozammal termelődik. Az inokulum elkészítésénél ezen kívül eljárhatunk úgy is, hogy a táptalajt a vizes spóraszuszpenzió helyett liofilizált pellettel oltjuk be. A liofilizálásra szánt spóraszuszpenzió elkészítése hasonló a vizes spóraszuszpenzióéhoz, azzal a különbséggel, hogy steril borjúszérumot használunk a steril desztillált víz helyett. Az NRRL 15232 mikroorganizmus széles - 25-37 °C - hőmérsékleti tartományban tenyészthető. Az A-51568 antibiotikum keverék optimális temelése 32-34 °C hőmérsékletnél történi k. Amint az az aerob süllyesztett tenyészeteknél szokásos, steril levegőt poriasztunk keresztül a tenyészleven. A tartályban történő termelésnél a mikroorganizmus kellő növekedéséhez szükséges levegő percenkénti térfogata a tenyészlé térfogatának 0,1 -0,25-szöröse a 100-300 percenkénti fordulatszámmal végzett keverés mellett. 100 liter tenyészlevet tartalmazó 165 literes tartálynál, percenkénti 200 fordulatszámú keverés mellett az átáramoltatott levegő optimális mennyisége a tenyészlé térfogatának 0,15-szöröse percenként. Az antibiotikus aktivitás rendszerint 24 óra elteltével jelenik meg és legalább 168 órás fermentációs időn keresztül megmarad. Az antibiotikum termelés csúcsa a 90. és 114. óra közé esik. Az antibiotikum keverék termelődésének fokozására p-hidroxi-fenil-glicint adhatunk a tenyészethez 5.10'3 M/ml koncentrációban. Egyik kísérletünknél p-hidroxi-fenil-giicin hozzáadásával a termelés 64%-kal növekedett. Befolyásolható az antibiotikum termelés a foszfát koncentrációval is. Egyik kísérletünkben a foszfát koncentrációnak már csökkentése is 20%-os termeléscsökkenést jelentett. Az antibiotikus aktivitás a lecentrifugált fermeritlé felülúszójában van. Mintavételnél a fermentlevet 15 percig 1000 g értéknél centrifugáljuk és az elválasztott felülúszót bioló— g'ailag értékeljük agar lemezen, Micrococcus liteus ATCC 9341 mikroorganizmust használva. Az A-51568 antibiotikum keverék termelődését a fermentáció alatt agar vagy diffúziós módszerrel - Bacillus subtilis ATCC 6633 törzset használva -, vagy turbidimetriás eljárással - Staphylococcus aureus ATCC 9114 m kroorganizmust használva - követjük nyomon. A találmány tárgya eljárás az <1) általános képletű antibiotikumok előállítására Nocardia orientalis NRRL 15232 mikroorganizmus vagy annak A-51568 antibiotikumot termelő mutánsának vagy variánsának tenyészetével asszimilálható szén- és nitrogénforrásokat, valamint szervetlen sókat tartalmazó táptalajon süllyeszetett, aerob fermentációs körülmények között. A találmány teljesebb illusztrálása céljából az alábbi, példákat adjuk meg. 1. példa A Nocardia orientalis NRRL 15232 ferde agar tenyészetéhez a következő összeállítású táptalajt használjuk: előfölözött zabliszt 60.0 g élesztő 2.5 g K2HPO4 1.0 g Czapek-féle sóoldat 5.0 ml agar 25.0 g deionizált vízzel 1,0 literre feltöltve. A Czapek-féle sóoldat az alábbi összetétel: KCI 10.0 g MgS04-7H20 10.0 g FeS04-7H20 0.2 g ionmentes vízzel 100 ml-re feltöltve. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
