192892. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,5-diketo-d-glükonsav-reduktáz előállítására
l'l 192892 15 Hőmérséklet (°C) Enzimaktivitás1 (egység/ml) 27.5 44 30 54 32.5 59 35 64 40 67 45 44 50 10 * Enzimaktivitás: 1 ml tisztított enzimoldat aktivitása Ca-25DKG szubaztrátumra 7 pH-értéken. Amint az a táblázatból kitűnik, a találmány szerinti enzim aktivitása nó a hőmérséklet növekedésével 40 °C-ig, de növelve a hőmérsékletet 45 °C-ra és még magasabbra, az aktivitás csökken. VI) A Km-érték mérése A fenti 5)ii) eljárás szerint mérjük a redukciós reakciók sebességét a Ca-25DKG különböző, 0,01 mól és 0,25 mól közötti koncentrációval, s így meghatározzuk a 25DKGKM-értékét. A mérések eredményeképpen azt találjuk, hogy a Km-érték 1,8±1,0 mmól. 2. példa 1) Sejttenyésztés I) Tápközeg a tenyésztéshez 12 liter alábbi összetételű tápkőzeget 20 literes fermentor-edénybe helyezünk és 120 °C-on 20 percig sterilizáljuk: D-glükóz 1.054 Kukoricalekvár 1.0% É Iszetökivonat (Difco) 0.2% Pepton (Difco) 0.5% KHjPOt 0.1% MgSOt.7HjO 0.02% pH = 7 II) Tenyésztés 15 Az 1. példa 1) része szerinti tépközeggel és az olt ismertetett módon két-két előtenyészetet készítünk a Corynebacterium sp. No. K-106 (ATCC 31 088, rövidítve K-106) ^ és a Corynebacterium sp. No. T-13 (ATCC 31 089, rövidítve T-13) baktériumokhoz. A fenti előtenyészeteket átoltjuk az i) rész szerint készített tápközegbe és 0. 5 térf./térf./perc levegőztetéssel és 25 400 ford/perc keverés mellett 28 °C-on 18 órán át tenyésztjük. A tenyésztés végén a sejtek mennyisége optikai sűrűségben (OD) megadva, a következő: a K-106 törzsre OD = 11,8; a T-13 törzsre OD = 12,2. 30 2) Az enzim kivonása A K-106 és T-13 törzsekről 0,02 mólos trisz-pufferban (pH = 7,0) OD = 150 sűrűségű sejtszuszpenziót készítünk, a tenyészetből centrifugélással elkülönített sejteket az 1. példának 2) része szerint mosva. A szuszpenziókban lévő sejteket (700 kg/cm!) nyomást alkalmazva (French press) elroncsoljuk. A sejteket tartalmazó oldatokat centrifugáljuk (15.000 g, 30 perc), amint azt az 1. példa 2) részében ismertettük, s így a még ép sejteket és a sejttörmeléket eltávolítjuk. A sejtkivonatokat így a kővetkező enzimaktivitáso^5 Kát mutatják: Törzs A kivonat mennyisége Protein A 25DKG reduktáz aktivitása K-106 400 ml 10 mg/ml 2.1 egység/ml T-13 400 ml 12 mg/ml 2.0 egység/ml 3) Az enzim tisztítása 55 I) Kisózás ammónium-szulfáttal A 30-70%-os telítettségig ammónium-szulfáttal kisózott frakcióknak megfelelő proteineket az 1. példa 3) része szerint elkülönítjük, majd 0,02 móloB trisz-pufferban feloldjuk, és az oldatokat 4 °C-on éjszakán ét 0,02 mólos trisz-pufferral dializáljuk. A dializált oldatok enzimaktivitása a következő: Törzs Az enzimoldatok mennyisége Protein A 25DKG-reduktóz aktivitása K-106 74 ml . nem vizsgáltuk 7.0 egység/ml T-13 88 ml 11.1 mg/ml 4.8 egység/ml 9
