192892. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,5-diketo-d-glükonsav-reduktáz előállítására
2 192832 3 A találmány tárgyát 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz előállítása képezi. A fenti enzim redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfál jelenlétében katalizálja a 2, 5-diketo-D-glűkonsav redukcióját 2-keto-L-guIonsavvá, a C vitamin Biotermékévé. Az enzim katalizálja továbbá az 5-keto-D-fruktóz redukcióját L-azorbozzá. A 2-keto-L-gulonBav előállítását 2, 5-diketo-D-glükonsavból egy Corynebacterium nemzetséghez tartozó mikroorganizmus sejtkivonatait használva, ismerteti például a 00 88 408 számú európai szabadalmi leírás és a 2 116 549 számú brit szabadalmi leírás. Ezideig nem ismertették azonban, hogy egy tisztított enzim a fenti két enzimhatással rendelkezik és ehhez általában redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát szükséges. A találmány célját tehát az új 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz előállítása képezi. A találmány másik célja eljárás kidolgozása az új 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz előállítására. A találmány szerint előállított 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktáz a következő fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkezik: a) enzimaktivitás: katalizálás redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát mint koenzim jelenlétében, i) 2, 5-diketo-D-glükonsavnak vagy BÓinak a redukciója 2-keto-L-gulonsavvá vagy megfelelő bóí-, vá, és ii) 5-keto-D-fruktóz redukciója L Bzorbózzá, b) fajlagosság a szubsztráturaokra: az enzim fajlagos a 2, 5-diketo-D-glükonsavra é3 az 5-keto-D-fruktózra, c) optimális pH-érték: pH - 6-7, d) pH-stabilitás: pH = 5-7, e) molekulasúly: 29.000±2.000, f) izoelektromos pont: pH = 4,4±0,3. A találmány tárgyát képezi az eljárás az új enzim előállítására a Corynebacterium nemzetséghez tartozó mikroorganizmus feltárt sejtjeiből izolálva. Tanulmányozva azokat az enzimeket, amelyek a 2, 5-diketo-D-glükonsvat redukálják és amelyeket számos 2-keto-L-gulonsavat termelő mikroorganizmus hordoz, a jelen találmány feltalálói azt találták, hogy a Corynebacterium nemzetséghez tartozó 2-keto-L-gulonsavat termelő törzsből előállított 2, 5- -diketo-D-glükonsav-reduktáz redukált nikotinaraid-adenin-dinukleotid-foszfát jelenlétében i) redukálja a 2, 5-diketo-D-glükonsavat 2-keto-L-gulonsavvá, és ii) redukálja az 5- -keto-D-fruktózt L-szorbózzá. A feltalálók kiegészítették továbbá a találmány szerinti eljárást azzal, hogy sikerrel izolálták és tisztították az új enzimet, amely még nem ismertetett hatásokkal rendelkezik (az, hogy Ős8zeférhetően fejti ki mindkét hatást, kiváltképpen eddig még nem ismert felfedezés). Az enzim bár, a 2, 5-diketo-D-glükonsavra és az 5-keto-D-fruktózra fejt ki enzimaktivitást, nem redukálja az 5-kelo-D-gIükonsavat, amelynél igencsak ketocsoport van az 5-helyzetben és ez közös a két szubsztrátumnál. Sőt, az enzim nem mutat redukáló hatást sem ketózokra, így a D-fruktőzra és L-szorbózra, amelyek a terminális alkoholos hidroxicsoporttal szomszédos ketocsoportol tartalmaznak, sem a 2-keto-L-gulonsavra vagy a 2-keto-D-glükonsavra. Az enzim sejten belüli enzim, amit a Corynebacterium nemzetséghez tartozó, 2-keto-L-gulonsavat termelő törzs sejtjeiből vonunk ki. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható mikroorganizmus például a Corynebacterium 8p. No. 20A-77, ATCC 31 090, FERM-P 2 770, egyike a Corynebacterium nemzetséghez tartozó 2-keto-L-glükonaavat termelő törzseknek és egy ebből a törzsből származó mutáns például egy olyan mutáns, amely bz 5-keto-D-glükonsavat tökéletlenül metabolizálja, így a FERM-BP 108. A Corynebacterium sp. No. T-13, ATCC 31 089, Corynebacterium sp. No, K-106, ATCC 31 088 és az ezekből a törzsekből származó bármely mutáns ugyancsak alkalmazható enzimforrésként. A mikroorganizmusok deponálási helye a feltalálók által: Fermentation Research Institute, Yalabe, Japán, mint FERM-Ps vagy FBRM-BP8 és/vagy az American Type Culture Collection, Maryland, U.S.A. mint ATCC-k, és minták kaphatók ezekből a raktárakból a budapesti szerződés rendelkezése alapján. A No. 20A-77, T-13 és K-106 törzsek részletes taxonómiai ismertetései megtalálhatók például a 3 959 076 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, és az induktív mutáció módszerét FERM-BP 108 törzzsé az eredeti 20A-77 törzsből részletesen ismerteti például a 0 088 408 számú európai szabadalmi leírás. A találmány szerinti 2, 5-diketo-D-glükonsav-reduktsz előállítására szolgáló, 2-ke‘.o-L-gulonsavat termelő törzsek szaporításába használt tépközeg összetételét nem korlátozzuk különösebben. A tápközeg célszerűen tartalmazzon szénforrásokat, nitrogénforrásokat, más szervetlen sókat és a törzsek által asszimilálható más elemek nyom-mennyiségeit. Szénforrásként cukrok, így D-glükóz és szacharóz, szerves savak, így glükonsav, glicerin és hasonlók használhatók 1-3%-os vizes közegben. Nitrogénforrásként pepton, kukoricalekvér és hasonlók alkalmazhatók 0,5-5%-ban. Használhatunk még a szaporításhoz foszfátot, amely lényeges, magnéziumsót, vitamint és más fémsók nyommennyiségeit. A táptalajt beoltjuk a fentemlített, 2-keto-L-gulonsavat termelő törzzsel, és ezt a tenyészetet a mikroorganizmus elszaporítása céljából 15-30 órán át 25-35 °C-on inkubáljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
