192668. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 15 alfa-hidroxi-4-androsztén-3,17-dion mikrobiológiai előállítására
2 192668 3 A találmány tárgya eljárás 15oc-hidroxi-4-androsztén-3,17-dion előállítására 4-androsztén-3,17-dion mikrobiológiai hidroxilezésével. Régóta ismeretes, hogy számos mikroorganizmus rendelkezik azzal a képességgel, hogy szteroidokat a 15cc-helyzetben hidroxilezzen. (2 889 255 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leirás). A 4-androsztén-3,17-diont is már többféleképp hidroxilezték a 15<c-helyzetben. (W. Charney and H. L. Herzog: Mikrobial Transformations of Steroids, Academic Press New York, 1967, 107-108. oldal). Amennyire az irodalomból kideríthető, a legjobb eredményeket akkor érték el, ha a fermentációhoz a Fusarium lini (CBS) (Helvetica Chimica Acta 45, 1963, 889 f) vagy Pénicillium spec (ATCC 11 598) (Endocrinology 83, 1968, 349) fajok mikroorganizmusait használták. A 15oc-hidroxi-4-andro8ztén-3,17-dion ipari előállítására ezek az ismert eljárások túl költségesek, mivel ezeknél nem egyszer 100 mg 4-androsztén-3,17—dión átalakításához egy liter fermentlé és egy nap fermentációs idő szükséges. A 4 036 695 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásból másrészt ismeretes, hogy a 4-androsztén-3,17-dionhoz képest izomer 18-metil-4-ösztrén-3,17-dion nagy szubsztrátkoncentrációknál hidroxilezhető a 15oc-helyzetben, ha a fermentációhoz a Pénicillium raistrickii (ATCC 10 490) fajhoz tartozó mikroorganizmusokat használunk. A 4-androsztén-3,17-dion fermentációja ezzel a mikroorganizmussal meglepő módon rendkívül rossz eredménnyel megy. Felfedeztük, hogy a 4-androsztén-3,17- -dion a 15oc-helyzetben nagyon jól hidroxilezhetó, ha a fermentáláshoz a Pénicillium stoloniferum (CBS P 102), Pénicillium melinii (CBS P 30) vagy Fusarium oxysporum f. vasinfectum (ATCC 7808) fajok mikroorganizmusait használjuk. Ezt a fermentációt olyan körülmények között végezzük, amilyeneket rendszerint szteroidok gombatenyészetekkel végzett mikrobiológiai hidroxilezése során alkalmaznak, így először is általánosan szokott előkisérletekben megtörténik a legkedvezőbb fermentáció körülmények, mint például a legkedvezőbb táptalaj, a megfelelő szubsztrátoldószer vagy szubsztrátszuszpendálószer, a szubsztrátkoncentráció, a technikai körülmények, Így hőmérséklet, levegőztetés, a pH-érték és a tenyésztés optimális idejének, a szubsztrát hozzáadásának és a mikroorganizmus enzimével való szubsztrátérinkezésnek a kiválasztása analitikailag, különösen vékonyréteg-kromatográfiásan. Célszerű a szubsztrátot a táptalaj literére számítva körülbelül 1000-től 5000 mg-ig terjedő koncentrációban alkalmazni. A pH-értéket előnyösen 5-től 7-ig terjedő tartományban tartjuk. A tenyésztési hőmérséklet 20-tól 40 °C-ig, előnyösen 25-től 35 °C-ig terjedő tartományban van. Levegőztetés céljából a tenyészoldatba literenként és percenként előnyösen 0,5-5 liter levegőt vezetünk be. A szubsztrát átalakulását célszerűen vékonyréteg-kromatográfiás analízissel követjük. A fermentációs idő körülbelül 30-90 óra. A kapott 15oc-hidroxi-4-androsztén-3,17- -dion értékes köztitermék, amely például 15/J,160-metilén-4-androsztén-3,17-dion (3 470 160 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leirás) vagy 15ű,16fl-metilén-3- -oxo-17cc-pregna-4,6-dién-21,17-karbolakton (4 129 564 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leirás) előállítására alkalmas. A következő példák a találmány szerinti eljárás részletesebb szemléltetésére éB a termék alkalmazásának bemutatására szolgálnak. A) Példák a találmány szerinti eljárás szemléltetésére: 1. példa Egy 2 literes Erlenmeyer lombikban 500 ml táptalajt, amely 3,0%, glükózt, 1,0% kukoricalekvárt, 0,2% nátrium-nitrátot, 0,1% kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,2% dikálium-hidrogén-foszfátot, 0,05% magnézium-szulfát-heptahidrátot, 0,002% vas(II)-szulfát-heptahidrátot és 0,05% kálium-kloridot tartalmaz, és autoklávban 120 °C-on 30 percig sterileztük, beoltunk Pénicillium stoloniferum (CBS P 102) törzs ferde agaros tenyészetével, és 28 °C-on rázóasztalon 2,5 napig rázatjuk. A tenyészet 250 ml-ével beoltunk egy 20 literes előfermentort, amely 15 liter 121 °C-on és 1,1 bar túlnyomáson 60 percig sterilezett, 1,0% kukoricalekvárt, 1,0% keményítőcukrot, 1,0% Bzójaport, 0,2% nátrium-nitrátot, 0,1% kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,2% dikálium-hidrogén-foszfátot, 0,05% magnézium-szulíát-heptahidrátot, 0,002% vas(II)-szulfát-heptahidrátot és 0,05% kálium-kloridot tartalmazó táptalajjal van töltve. Habzásgátlószerként Silicon SH-t hozzáadva 29 °C-on és 0,7 bar túlnyomáson 15 liter/perc levegőztetéssel és 220 ford./perc keverés közben 24 óra hosszat fermentálunk. Utána ebből a tenyészetből steril körülmények között 0,9 litert keveszúnk, és ezzel beoltunk egy 20 literes föfermentort, amely 14 liter, az előfermentoréval azonos összetételű és ahhoz hasonlóan sterilezett táptalajjal van töltve. Az előfermentációhoz hasonló körülmények között végzett 12 órás tenyésztési szakasz után hozzáadjuk 22,5 g 4- -androsztén-3,17-dion 200 ml dimetil-formamiddal készített és sterilre szűrt oldatát, és tovább keverjük és levegőztetjük. A fermentlét 60 órás tenyésztési idő után 3 x 10 liter metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, az extraktumokat egyesitjük, és kúszófilmes bepárlón azonnal betöményitjük, végül 50 °C fürdőhómérsékleten vákuumban rotáciÓB bepárlón szárazva bepároljuk. A maradékot a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
