192617. lajstromszámú szabadalom • Eljárás különleges tisztaságú hialuronsav előállítására

1

192 617

IV. Táblázat

2

Hialuronsav-oldatok tisztaságának vizsgálata; fehérje- nukleinsav- és hialuronsav-tartalom

Koncentráció

Tisztítási lépés

Fehérje

mg/ml

Nukleinsav

üg/ml

Hialuronsav

mg/ml

Etanol

Izopropanol

Etanol

Izopropanol

Etanol

Izopropanol

Első vizes oldás

0,52

0,66

17,3

12,8

4,0

3,5

Második vizes oldás

0,32

0,44

7,6

8,5

5,4

4,9

Harmadik vizes oldás

0,32

0,22

7,0

6,9

9,3

9,8

Negyedik vizes oldás

0,08

0,10

5,0

4,3

10,2

9,8

(Végső koncentráció: l%-os,vizes oldat)

II. táblázatban felsorolt különböző, 1% HA tartalmú készítmények nukleinsavtartalmának további vizsgálatát géllemezen végzett elektroforézissel végezzük. Ezzel a vizsgálattal a DNS és a RNS megkülönböztethetők egymástól. Az elektroforézis elvégzése után a 30 nukleinsavat a 0,8%-os alacsony endozmózisu, 2 ßgj ml etidium-bromid-tartalmú agarózon rövidhullámhosszúságú U. V. fénnyel tesszük láthatóvá. A DNS, mivel molekulatömege jóval nagyobb, a felvitel helyének közelében marad, míg az RNS az oldószerffont- 35 tál vándorol. Az elektroforézist 18 órán át, 90 V feszültségen, Canalco Slab Gel készülékben 25 ß\ minta alkalmazásával végezzük. Eredményeink szerint négy készítményünk, illetve a HYARTILr készítmény egyike sem tartalmaz kimutató mennyiségű 40 nukleinsavat, míg a HYLOVETTM készítmény RNS formájában jelenlévő jelentős mennyiségű nukleinsavat tartalmaz.

A különböző HA készítmények molekulatömegének vizsgálatára nagynyomású folyadékkromatográfi- 45 ás (HPLC) eljárást alkalmazunk. Ez az eljárás modernebb és pontosabb, mint a már említett 4 141 973. számú szabadalmi leírásban szereplő, viszkozitásmérésen alapuló eljárás. Ezideig csak egy fajta oszlopot, a „Waters Micro Bondagel/E-High A”-t használtuk 50 a molekulatömeg meghatározására. Nem tudtunk a vizsgált mintával együtt olyan molekulatömeg tartományba eső vizes standard mintákat futtatni az oszlopon, amelyek a molekulatömeg pontos meghatározásához szükségesek lettek volna. így a relatív mole- 55 kulatömeget az oszlopon való áthaladást jelentő retenciós idővel határozzuk meg. Elméletileg ennek az eljárásnak az alkalmazása esetén minél rövidebb időn belül észleljük a csúcsot, annál nagyobb a lejövő anyag molekulatömege. Az oszlop retenciós ideje 60 10 perc, a minimális és maximális mérhető molekulatömeg 15 00—7 000 000. Az 1 —4. ábrán az első négy fermentáció termékének HPLC diagramja látható.

Az 5-7. ábrán ugyanez láthatón ismert termékekre, a Hyaluron (Miles), HLARTILr (Pharmacia) és a 65

HYALOVETTM (Tranns Bussan) készítményekre (1-3. ismert termék) vonatkozóan. Meghatároztuk a csúcsok és vállak retenciós idejét (0—10 perc) és ennek a molekulatömeggel (15 000 — 7 000 000 tartományban, való lineáris kapcsolata alapján számítottuk a relatív molekulatömegeket. A kapott relatív molekulatömegeket az V. táblázatban soroljuk fel. Mint az az 1—4. ábrákon látható HPLC eljárással elválasztott, a találmány szerint előállított HA lényegében egyetlen alapvetően szimmetrikus, nagy molekulatömegű ( 2 millió fölötti átlagos molekulatömegű) csúcsot ad. Az 1—4. ábrákon láthatóan a HA-nak legalább 98%-a ezen a csúcson belül található. Az ismert, kereskedelmi forgalomban lévő készítmények molekulatömeg eloszlása, amely az 5—7. ábrákon látható, nem ilyen szoros tartományon belül szabályozott. Az 5. ábrán az 1. ismert termék, a Hyaluron HA készítmény (Miles), a 6. ábrán a 2. ismert termék, a HYALOVET készítmény (Trans Bussan), a 7. ábrán a 3. ismert termék, a HYATRILr készítmény (Pharmacia) HPLC eljárással kapott frakcióeloszlása látható. Úgy véljük, hogy a találmány szerinti készítmény molekulatömegének szűk tartományon belüli szabályozottsága az extrakciós eljárás egyszerűségének — amennyiben csak minimális nyíróhatással járó lépés szerepel — valamint a molekulatömeg csökkentésére képes hialuronidáz-enzim hiányának tulajdonítható.

Mint említettük a találmány szerint előállított bakteriális eredetű HA egységek relatív molekulatömeg tartománya szűk, a mért értékek többsége, 98%-a, 1 100 000 körüli vagy a 2 200 000 - 4 000 000 tartományba esik. Ugyanezzel az eljárással végezve a vizsgálatot megállapítottuk, hogy a HYALOVET három különböző, 2 700 000, 1 700 000, illetve molekulatömegű egységet tartalmaz. A HYARTILr készítmény pedig 10 000 - 3 700 000 közötti molekulatömegű HA sort tartalmaz. Mint látható, molekulatömeg szempontjából a HYATRILr mutatja a legszélesebb variációt.

6