192587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új peptid tipusú anyarozs-alkaloidok dúsítására és tisztítására
1 192 587 2 pH 5,2, állítva I-jelű táptalaj: tömény vizes ammónium-hidroxiddal t ripkazin 7,0 g/1 citromsav 4,1 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát 0,3 g/1 magnézium-szulfát 0,3 g/1 pH 5,7, tömény vizes ammónium-hidroxiddal állítva K-jelű táptalaj: szacharóz 100,0 g/1 citromsav 10,0 g/1 nátrium-klorid 10,0 gA kálium-dihidrogén-foszfát 0,5 gA pH 5,7, tömény vizes ammónium-hidroxiddal állítva St-jelű táptalaj : szacharóz 100,0 gA borostyánkősav 10,0 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát 0,25 gA magnézium-szulfát 0,25 g/1 ammonium-nitrát 1,0 g/1 kalcium-klorid 1,0 gA pH 5,2, tömény vizes ammónium-hidroxiddal állítva. A H, J, K és St jelű táptalajok összetevőit kb. 800 ml vízben oldjuk, a pH-t megadott értékre állítjuk, majd 1000 tnl-re való térfogatkiegészítés után 110 °C-on 25 percig sterilezzük. A fermentációt önmagában ismert módon végezzük, de annak módját az egyes példákban is megadjuk. Ugyan-35 10 15 20 25 30 így, drog-eredetű peptid-alkaloid esetén is ismertetjük a megfelelő példában az önmagában ismert drogextrakciós módszert is. A fermentativ vagy drog-extrakciós úton nyert vizes fermen tlevet, ill. kivonatot ezután ún. makroretikuláris gyantán adszorbeáltatjuk. A makroretikuláris gyanta az adszorpciós gyanták egy fajtája, melynek alapanyaga egy szintetikus előéletű (ko/polimer, s mely adszorptiv tulajdonságát nagy porozitásának (fajlagos-felülete mini- 40 műm 200 m2/g) és nagy pórusátmérőjének (minimum 30 Á) köszönheti. Ilyenek pl. az Amberíite típusú XAD2, XAD4, XAD7 és XAD8 jelű gyanták (gyártó: Rohm and Haas Co.) valamint a Diaion típusú HP 20, HP 21, EX207 ill. SP 207 jelű gyanták (gyártó: Mitsubishi Corp.) és a 45 Lowatit OC 1031 típusú gyanta (gyártó: Bayer AG). A gyantát alkalmazhatjuk szakaszos műveletben pl. a gyantának a tisztítandó alkaloidokat tartalmazó közegbe való bekeverésével, majd kiülepítésével vagy kiszűrésével. Alkalmazhatjuk továbbá nyugvó ágyas vagy mozgó 50 (fluid) ágyas műveletben, amikor is a tisztítandó alkaloidokat tartalmazó közeget áramoltatjuk át a gyantaoszlopon. Amennyiben a közeg szüretien, vagy feltárt sejtes fermentlé, célszerű a micéliumnál nagyobb fajsúlyú gyantát alkalmazni. 55 A gyantával érintkezésbe hozott folyadék pH értéke 3 -6, előnyösen 3,5 -5,5. Az adszorpciós folyamat után a gyantát először víz zel, majd lúgos vízzel (pH 11-13), majd újra vízzel mos suk, s ezután a gyantáról a peptid-alkaloidokat bármely, 60 az alkaloidkémiában szokásosan használt vízzel elegyedő szerves oldószerrel eluáljuk. Vízzel elegyedő' szerves ol dószerként alkanolokat, célszerűen 1—6 szénatomos al kanolokat, 1 —4 szénatomos vízoldható alifás ketonokat de dimetil-szulfoxidot, dimetil-formamidot, acetonitrilt 65 és dioxánt is alkalmazhatunk. Előnyös a metanol, etanol vagy izopropanol használata. Az alkalmazott oldószer a-lott esetben maximálisan 50 % vizet és/vagy 1-5 % savat is tartalmazhat. Az alkalmazott sav szervetlen sav, pl. foszforsav, kénsav, sósav, vagy vízoldható szerves sav, például borkősav, citromsav lehet. Ha a gyantán nemcsak a peptid-alkaloidokat, hanem a kísérőalkaloidként jelenlévő vízoldható anyarozs-alkaloidokat, elsősorban az ergometrint és epimeijét is adszorbeáltuk, akkor először a vízoldható alkaloidokat e'uáljuk alkanollal, majd szelektíven a peptid-alkaloidokrt 1-5, célszerűen 2 % szervetlen savat vagy vízzel elegyedő szerves savat tartalmazó vízzel elegyedő szerves oldószerrel eluáljuk. Az alkalmazott szerves oldószer és a sav a fentiekben részletezett lehet. A vízoldható szerves oldószer adott esetben max. 50 % vizet is tartalmazhtt. A kísérőaikaloidként jelenlévő vízoldható alkaloidok mennyisége az összalkaloidtartalom 25-75 %-a, vagy ennél kevesebb. Az eluátumból ismert módon, bepárlással és/vagy sóképzéssel izoláljuk a peptid-alkaloidokat. A találmány tehát eljárás peptid-típusú anyarozs-alkaloidok adszorpciós módszerrel történő tisztítására és dúsítására, oly módon, hogy az adott esetben maximálisan 75 % vízoldható anyarozs-alkaloidokat tartalmazó peptidalkaloidokat vizes közegben, önmagában ismert módszerekkel valamely makroretikuláris gyantán megkötjük, és a gyantáról először a festék- és zsíranyagokat 9- 14pH-ra liigosított vízzel leoldjuk, majd a) a peptid-típusú anyarozs-alkaloidokat valamely, adott esetben maximálisan 50 % vizet és/vagy 1 -5 % szervetlen vagy vízzel elegyedő szerves savat tartalmazó, vízzel elegyedő szerves oldószerrel eluáljuk, vagy b) vízoldható anyarozs-alkaloidok jelenléte esetén, a vízo dliató alkaloidokat 1-6 szénatomos alkanollal vagy adott esetben maximálisan 50 % vizet tartalmazó 1-6 S/énatomos alkanollal, majd a peptid-típusú alkaloidokat 1-5 % szervetlen savat vagy vízzel elegyedő szerves srvat és adott esetben maximálisan 50 % vizet tartalmazó, vízzel elegyedő szerves oldószerrel eluáljuk. A találmányt közelebbről a következő példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy igényünket a példákra korlátoznánk. 1. példa ATCC 20103 számú Claviceps purpurea törzs 14 napos, E-jelű táptalajon nőtt ferde agar tenyészetét 5 ml fiziológiás sóoldattal lemossuk, homogenizáljuk. A homogén szuszpenzió 2 ml-ével 3000 ml-res Erlenmeyer lombikban előkészített 400 ml F-jelű táptalajt oltunk. A tenyészetet 24 °C-on 3 napig rázatjuk, majd két 10 literes üvegfermentorban lévő 5—5 1 F-jelű táptalajra oltjuk. Az oltótenyészetet 24 °C-on levegőztetve, keverve 48-50 órán keresztül inkubáljuk. 160 1-es saválló acélfermentorban sterilezett 100 1G jelű táptalajt oltunk az inokulummal. A tenyésztést levegő átáramoltatás és keverés közben 24 °C-on 14 napig folytatjuk. A fermentáció befejezésekor a fermentlé pH értéke 49, összalkaloidszintje 1820 pg!m\. Az alkaloid-komponensek mennyisége folyadékkromatográfiás módszerrel meghatározva: 1460 jug/ml ergokrisztin, 150 jug/ml ergokásztinin, 190 jug/ml ergotamin és 30 /ig/ml ergotaminin. A fermentlé 50 1-éből nagyfordulatszámú keverős horr ogenizálóban (2000 ford/perc) 10 percig sejtroncsolást 3
