192569. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírusgenomok és származékaik fenntartására és elszaporítására
1 192 569 2 genitása korlátozott, vagy amelyek beépített, vírusidegen genetikai információt tartalmaznak, amely előnyösen egy növényből származik, és genomja különbözik attól a növénysejttől vagy szövettől, amely a vírusgenomot vagy annak derívátumát tartalmazza. így a tenyésztett növénysejtek vagy szövetek például a beépített, vírusidegen genetikai anyagot hordozó Cauliflower-Mosaic-Virus genomját tartalmazhatják, különösen olyan növényi anyagot, amelynek genomja eltér a Cauliflower-Mosaic-Vírust tartalmazó növénysejtek és szövetek genomjaitól. Növényként, amely a Cauliflower-Mosaic-Virust tartalmazza, főleg a Brassica rapa, például a Brassica rapa cv Just Right jöhet számításba. A találmány a termesztett növényekre is vonatkozik, amelyek a vírusgenomokat vagy derivátumaikat tartalmazzák és azok a vírusgenomokat vagy derivátumokat tartalmazó protoplasztokból termesztéssel állíthatók elő, beleértve azok szaporulatait, amikoris a szaporulat mind ivarosán, mind vegetatív úton előállítható. Egy további szempont az agaróz felhasználása a vírusgenomokat vagy azok derivátumait tartalmazó növénysejtek vagy szövetek előállítása és tenyésztése során az ugyanazon vírusgenomokat vagy derivátumaikat tartalmazó izolált, növény protoplasztokból. A találmány tárgyát képezi továbbá a vírusok in-vitromutánsainak szaporítása. Ilyen mutánsok akkor szaporíthatok, ha az izolált, növényi protoplasztok genetikailag manipulált vírusokkal vagy vírusgenomokkal fertőzöttek, és egy megfelelő tápközegben, előnyösen agarózzal mint gélképző anyaggal kezelt táptalajon a növény differenciálódásáig tenyésztjük azokat. A találmány tárgyához tartozik továbbá az in-vitro-vírusmutánsok felhasználása, amelyet a fentiekben leírtak szerint genetikailag manipulált vírusokból vagy vírusgenomokból lehet szaporítani a protoplasztok transzformációs rendszerében. A vírusszaporítás a protoplasztokból álló sejttenyészetben két különböző úton végezhető el: a) a sejttenyészet-DNS hibridizációja radioaktív jelölt vírus DNS-sel, vagy b) az egészséges növény reinfekciója a sejttenyészet extraktumaival. A protoplasztok izolálásának és a vírus szaporodás kimutatásának módszere ismert. Előnyös a módszert a mindenkori adottságoknak megfelelően változtatni. A következőkben az izolált protoplasztok kinyerését írjuk le, valamint a protoplaszt-és sejtszaporítás, valamint a vírusszaporítás kimutatásának példáit mutatjuk be. A Brassica rapa-t (Wasserrübe, Trunip) növényházban termesztjük és azt 5 leveles állapotban a virológiában ismert módszerrel (a vírusszuszpenzió bedörzsölése a levél színén dörzsporral, szilicium-karbid porral okozta mechanikai sebzéssel) a Cauliflower-Mosaic-Virussal fertőzzük. A szisztemikusan fertőzött növényeket növénynevelőkamrába visszük, és ott az alábbi feltételek között tenyésztjük: 12/12 óra fény/sötétség ritmus, 5000 Ix fényintenzitás a SILVANIA daylight típusú fénycsővel, 27 °C nappali és 20 °C éjszakai hőmérséklet, állandó 70 % relatív páratartalom, naponta kétszeri öntözés a talaj(tőzeg)homokkeverékben, cserépedényben fejlődő növényeket 0,1 %-os növény mű trágya-koncentrátummal, mint a Greenzit ® tápoldattal (Ciba-Geigy AG, Basel). A protoplasztok izolálásához a szisztemikusan fertőzött növények kb. 12 cm hosszú leveleit használjuk fel. A leveleket csapvízzel lemossuk, 30 percig 0,5 %-os kalcium-hipoklorit-oldatban sterilezzük és végül gondosan, steMESX: 2-(N-morfolino)-etáuszulfcmsav, Sigma cég terméke, száma: M-8250 ril körülmények között, steril munkaasztalon ötször, ionmentesített, steril vízzel mossuk. A levéllemezt 2 cm széles csíkokra feldaraboljuk, egymásra helyezzük és éles borotvapengével 1 mm széles levélkeresztmetszeteket készítünk. A levélkeresztmetszeteket a következő összetételű, ozmotikusán stabilizált enzimoldatba helyezzük, amely a szövetbe vákuumszerűen beszűrődik, 1 %-os cellulázi (cellulase, ONOZUKA RIO) + 0,1 %-os pektinázt (pek’inase, MACEROZYME RIO, mindkettő a Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. 8—21 Shingikan-cho, Nishinomiya, Japán cég terméke) oldunk egy elegyben, amely 0,45 mól/1 mannitot (3 tf) és 0,17 mól/1 kalcium-kloridot (tf/I) tartalmaz, a pH-t 5,4-re állítjuk be 0,1 mól/1 kálium-hidroxiddal. Az enzimoldat ozmotikus értéke kb. 510 mOs/kg H20. A szövetmetszeteket 16 órán át, 12 °C-on inkubáljuk, a szövetek túlnyomó része izolált protoplasztokká bomlik. A protoplasztszuszpenziót 100 mikrométer lyukbőségű acélszűrővel a fel nem oldódott szövetrészektől elválasztjuk és steril centrifugacsövecskékbe helyezzük át, 10 percig 750 fordulat/perc, ülepítjük (szedimentáiás). Az ülepített (szedimentált) protopias/tokat steril ozmotikumban(0,175 mól/1 kalcium-kloridot és 0,5 % MESx-t tartalmazó pufferral, a pH-értéket 5,7-e állítjuk be, 510 mOs/kg H20-val) reszuszpendáljuk és 500 fordulat/perc-en ülepítjük, reszuszpendáljuk az czmotikumban és háromszor mossuk. A protoplasztokat ezt követően az 3. példa szerinti táptalajban reszuszpendáljuk és 8 x 104/ml populációsűrűségre állítjuk be. 1. példa A Brassica rapa protoplasztjainak tenyésztése Tápközeg: Kao, K. N. (1977), Molec. gen. Genet. 150,225-230 és Koblitz K. és Koblitz, D. (1982), Plant Cell Reports (1, 147-150) nyomán módosítva: NH4N03 600 mg/1 Na-purivát 5 mg/1 kno3 1900 mg/1 Citrát 10 mg/l CaCI2 ' 2H20 600 mg/1 Maleát 10 mg/1 MgS04 - 7H20 300 mg/1 Fűm arát 10 mg/1 KH2P04 170 mg/1 Nikotin-amid 0,5 mg/1 KCí 300 mg/1 ' Píridoxín-HCI 0,5 mg/1 Fea3•6H2O 27 mg/1 Tiamin-HCl 5,0 mg/1 Na^EDTA 74,6 mg/1 D-Kalcium-pantotenát 0,5 mg/1 M11SO4 • 1H20 10 mg/1 Folát 0,2 mg/1 Na ;MoC>4 • 2H20 0,25 mg/1 p-Aminobenzoesav 0,01 mg/1 H3BO3 3,0 mg/1 Biotin 0,005 mg/1 ZnSC>4 ' 7H20 2,0 mg/l Kolin-klorid 0,5 mg/1 Cu 5O4 • 5H20 0,025 mg/1 Riboflavin 0,1 mg/1 CoC12 • 6H20 0,025 mg/1 Aszkorbinsav 1,0 mg/1 KJ 0,75 mg/i D3-Vítamin 0,005 mg/1 Fruktóz 125 mg/1 Bi2-Vitamin 0,01 mg/1 Ribóz 125 mg/1 m-Inozit 100 mg/1 Xüóz 125 mg/1 Kazein-hidrolizátum 125 mg/1 Mcnnóz 125 mg/1 2,4-Diklór-fenoxi -ecetsav 0,25 mg/1 Rsmnóz 125 mg/1 CY-Naftil-ecetsav 0,5 mg/1 Ceilobióz 125 mg/1 6-Benzilamino-purin 0,1 mg/1 Szorbit 125 mg/1 Szacharóz 20000 mg/1 M inait 125 mg/1 Glükóz 64500 mg/1 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
